Preparazione di virus dell'influenza aviaria H5 pseudo-tipizzati con metodo di trasfezione del fosfato di calcio e misurazione dell'attività neutralizzante degli anticorpi
Summary
Qui descriviamo un protocollo per il confezionamento di pseudovirus e la misurazione dell’attività neutralizzante degli anticorpi.
Abstract
Dal 1996, i virus H5 dell’influenza aviaria ad alta patogenicità (HPAI) del lignaggio A/goose/Guangdong/1/96 hanno causato epidemie influenzali nel pollame e negli uccelli selvatici. Occasionalmente, anche gli esseri umani ne sono vittime, il che si traduce in un’alta mortalità. Tuttavia, la ricerca sui virus HPAI è spesso ostacolata, considerando che deve essere gestita all’interno di laboratori di livello 3 di biosicurezza. Per affrontare questo problema, gli pseudovirus sono adottati come alternativa ai virus wild-type in alcuni esperimenti di studi H5 HPAI. Gli pseudovirus si dimostrano gli strumenti ideali per studiare gli anticorpi neutralizzanti contro i virus H5 HPAI. Questo protocollo descrive le procedure e le fasi critiche dei preparativi di pseudovirus H5 HPAI e dei saggi di neutralizzazione degli pseudovirus. Inoltre, discute la risoluzione dei problemi, la limitazione e le modifiche di questi test.
Introduction
Dal 1996, i virus H5 dell’influenza aviaria ad alta patogenicità (HPAI) del lignaggio A/goose/Guangdong/1/96 hanno causato continue epidemie di influenza nel pollame e negli uccelli selvatici, causando enormi perdite socio-economiche nell’industria avicola globale. A volte, anche gli esseri umani vengono infettati da esso, di fronte ad un alto tasso di mortalità 1,2. Tuttavia, la ricerca sul virus HPAI è spesso ostacolata, dato che non può essere gestita al di fuori dei laboratori di livello 3 di biosicurezza. Per affrontare questo problema, gli pseudovirus sono adottati come alternativa ai virus wild-type in alcuni esperimenti di studi H5 HPAI. Gli pseudovirus sono abbastanza sicuri da essere praticati nei laboratori di livello 2 di biosicurezza.
Gli pseudovirus H5 HPAI appartengono a virus chimerici costituiti da nuclei di virus surrogati, involucri lipidici con glicoproteine superficiali da virus influenzali e geni reporter. I nuclei di pseudovirus sono solitamente derivati dal virus dell’immunodeficienza umana lentivirale (HIV), dai retrovirus come il virus della leucemia murina (MLV) e dal virus della stomatite vescicolare (VSV)3. In particolare, il sistema di confezionamento dell’HIV-1 è ampiamente utilizzato per produrre pseudovirus influenzale, dove i geni primari forniti sono gag e pol. Il gene del bavaglio dell’HIV esprime le proteine di base. Il gene pol esprime l’integrasi e la trascrittasi inversa, entrambe necessarie per l’espressione del gene reporter nelle cellule trasdotte. Imitando il genoma del virus surrogato, il gene reporter è abbracciato nel nucleo dello pseudovirus in forma di RNA. Il gene reporter esprimerà la proteina nelle cellule ospiti. I livelli di espressione genica dei geni reporter possono essere utilizzati per misurare l’efficienza dell’infezione da pseudovirus 3,4. Il reporter principale è la lucciola luciferasi per misurare le unità di luminescenza relativa (RLU) o l’attività relativa della luciferasi (RLA) nelle cellule trasdotte. Vengono utilizzati anche altri reporter come lacZ, Gaussia e Renilla luciferasi, solo in misura minore5.
Gli pseudovirus sono strumenti ideali per studiare gli anticorpi neutralizzanti contro i virus HAPI H5. Per misurare la potenza degli anticorpi neutralizzanti, vengono utilizzati i saggi di neutralizzazione dello pseudovirus (PN)6. L’emoagglutinina (HA) e la neuraminidasi (NA) sono glicoproteine sulla superficie del virus dell’influenza A 7,8. L’HA è composto da un dominio globulare per il legame del recettore e un dominio dello stelo per la fusione della membrana. La proteina NA ha l’attività sialidasi per facilitare il rilascio del virus 7,8. Un test PN può misurare gli anticorpi neutralizzanti diretti alle proteine HA. Gli anticorpi neutralizzanti diretti alla testa e alla regione dello stelo dell’HA possono anche essere rilevati mediante test di attaccamento virale e di ingresso. Rispetto ai virus wild-type, gli esperimenti di neutralizzazione degli pseudovirus hanno valori di rilevamento più sensibili, possono essere gestiti in modo sicuro in un laboratorio di biosicurezza di livello 2 e sono generalmente più facili da utilizzare nella pratica.
Questo protocollo presenta in dettaglio le procedure e le fasi critiche dei preparati di pseudovirus H5 HPAI e dei saggi PN. Inoltre, discute la risoluzione dei problemi, la limitazione e le modifiche di questi test. In questo studio, il ceppo A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) dei virus HPAI H5N1 è stato utilizzato come esempio. Per ottenere i sieri immunitari utilizzati nei saggi, questo protocollo ha selezionato la proteina HA proveniente dal ceppo TH come immunogeno per immunizzare i topi.
Protocol
Representative Results
Discussion
HEK293FT cellule sono solitamente utilizzate come cellule di imballaggio per produrre pseudovirus. Il rilevamento regolare del micoplasma è essenziale durante la coltura cellulare. La contaminazione da micoplasma può ridurre drasticamente i raccolti di pseudovirus e talvolta vicino allo zero. Rispetto ad altre contaminazioni, le contaminazioni da micoplasma non portano a variazioni del valore del pH o torbidità del terreno di coltura cellulare. Anche un’alta concentrazione di micoplasma non è visibile ad occhio nudo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalle borse di ricerca dell’Innovation Capacity Building Project della provincia di Jiangsu (BM2020019), Shenzhen Scientific and Technological Project (No. JSGG20200225150702770), Programma di ricerca prioritaria strategica dell’Accademia cinese delle scienze (XDB29030103), Progetto scientifico e tecnologico del Guangdong (n. 2020B1111340076) e Programma di ricerca aperta del laboratorio della baia di Shenzhen (n. SZBL202002271003).
Materials
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | — | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | — | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
References
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