Denne protokol beskriver ekstraktion og visualisering af aggregerede og opløselige proteiner fra Escherichia coli efter behandling med en proteotoxisk antimikrobiel. Efter denne procedure giver mulighed for en kvalitativ sammenligning af proteinaggregatdannelse in vivo i forskellige bakteriestammer og/eller mellem behandlinger.
Eksponeringen af levende organismer for miljømæssige og cellulære belastninger forårsager ofte forstyrrelser i protein homøostase og kan resultere i protein aggregering. Ophobning af protein aggregater i bakterieceller kan føre til betydelige ændringer i cellulære fænotypiske adfærd, herunder en reduktion i vækstrater, stressresistens, og virulens. Der findes flere forsøgsprocedurer til undersøgelse af disse stressormedierede fænotyper. Dette papir beskriver en optimeret analyse til ekstraktion og visualisering af aggregerede og opløselige proteiner fra forskellige Escherichia coli stammer efter behandling med en sølv-ruthenium-holdige antimikrobielle. Denne forbindelse er kendt for at generere reaktive iltarter og forårsager udbredt proteinsammenlægning.
Metoden kombinerer en centrifugeringsbaseret adskillelse af proteinaggregater og opløselige proteiner fra behandlede og ubehandlede celler med efterfølgende adskillelse og visualisering af natrium dodecyl sulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og Coomassie farvning. Denne tilgang er enkel, hurtig og giver mulighed for en kvalitativ sammenligning af proteinaggregatdannelse i forskellige E. coli-stammer. Metoden har en bred vifte af anvendelser, herunder muligheden for at undersøge virkningen af andre proteotoksiske antimikrobielle stoffer på in vivoprotein aggregering i en lang række bakterier. Desuden kan protokollen bruges til at identificere gener, der bidrager til øget resistens over for proteotoksiske stoffer. Gelbånd kan bruges til efterfølgende identifikation af proteiner, der er særligt tilbøjelige til sammenlægning.
Bakterier udsættes uundgåeligt for et utal af miljømæssige belastninger, herunder lav pH (f.eks. i pattedyrs mave)1,2, reaktiv ilt- og klorart (ROS/RCS) (f.eks. under oxidativ burst i fagocytter)3,4,5, forhøjede temperaturer (f.eks. i varme kilder eller under varmechok)6,7og flere potente antimikrobielle stoffer (f.eks. AGXX anvendes i denne protokol)8. Proteiner er særligt sårbare over for nogen af disse stressorer, og eksponering kan provokere protein un-/misfolding at så frø sammenlægning. Alle organismer anvender beskyttelsessystemer, der giver dem mulighed for at klare proteinfoldning9. Alvorlig stress kan dog overvælde proteinets kvalitetskontrolmaskineri og forstyrre proteinernes sekundære og/eller tertiære struktur, som i sidste ende inaktiverer proteiner. Som følge heraf kan proteinaggregater alvorligt forringe kritiske cellulære funktioner, der kræves for bakterievækst og overlevelse, stressresistens og virulens10. Derfor er forskning med fokus på protein aggregering og dens konsekvenser i bakterier et relevant emne på grund af dets potentielle indvirkning på infektionssygdomsbekæmpelse.
Varmeinduceret protein, der udfolder sig og aggregering, er ofte reversibelt7. I modsætning hertil kan andre proteotoxiske belastninger, såsom oxidativ stress, forårsage irreversible proteinmodifikationer gennem oxidation af specifikke aminosyre sidekæder, hvilket resulterer i protein un-/misfolding og i sidste ende proteinaggregation4. Stressinduceret dannelse af uopløselige proteinaggregater er blevet grundigt undersøgt i forbindelse med molekylære chaperoner og deres beskyttende funktioner i gær og bakterier11,12,13. Der er offentliggjort flere protokoller , der anvender en række biokemiske teknikker til isolering og analyse af uopløselige proteinaggregater14,15,16,17. De eksisterende protokoller er hovedsageligt blevet anvendt til at studere bakterieprotein aggregering ved varmechok og/eller identifikation af molekylære chaperoner. Mens disse protokoller har helt sikkert været et fremskridt på området, der er nogle store ulemper i de eksperimentelle procedurer, fordi de kræver (i) en stor bakteriel kultur volumen på op til 10 L14,17, (ii) komplicerede fysiske forstyrrelser processer, herunder brugen af celleforstyrrende stoffer, fransk presse, og / eller sonikering14,15,17, eller (iii) tidskrævende gentagne vaske- og inkubation trin15,16,17.
Dette papir beskriver en modificeret protokol, der har til formål at løse begrænsningerne af de tidligere tilgange og tillader analyse af mængden af protein aggregater dannet i to forskellige Escherichia coli stammer efter behandling med en proteotoxisk antimikrobiel overfladebelægning. Belægningen består af metal-sølv (Ag) og ruthenium (Ru)-konditioneret med ascorbinsyre, og dens antimikrobielle aktivitet opnås ved generering af reaktive iltarter8,18. Heri er en detaljeret beskrivelse af præparatet af bakteriekulturen efter behandling med antimikrobiel forbindelse og en sammenligning af proteinaggregationsstatus ved eksponering af to E. coli-stammer med forskellige følsomhedsprofiler for stigende koncentration af det antimikrobielle stof. Den beskrevne metode er billig, hurtig og reproducerbar og kan bruges til at studere protein aggregering i nærværelse af andre proteotoxiske forbindelser. Derudover kan protokollen ændres for at analysere den indvirkning, som specifikke gensletninger har på proteinaggregation i en række forskellige bakterier.
Denne protokol beskriver en optimeret metode til analyse af proteinaggregatdannelse efter behandling af forskellige E. coli-stammer med en proteotoxisk antimikrobiel. Protokollen tillader samtidig udvinding af uopløselige og opløselige proteinfraktioner fra behandlede og ubehandlede E. coli-celler. Sammenlignet med eksisterende protokoller for proteinaggregatisolation fra cellerne14,15,16,<sup clas…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Illinois State University School of Biological Sciences start midler, Illinois State University New Faculty Initiative Grant, og NIAID tilskud R15AI164585 (til J.-U. D.). G.M.A. blev støttet af Illinois State University Undergraduate Research Support Program (til G.M.A.). K.P.H. blev støttet af et RISE-stipendium fra den tyske akademiske udvekslingstjeneste (DAAD). Forfatterne takker Dr. Uwe Landau og Dr. Carsten Meyer fra Largentech Vertriebs GmbH for at levere AGXX pulver. Figur 1, Figur 2, Figur 3, Figur 4og Figur 5 blev genereret med Biorender.
Chemicals/Reagents | |||
Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | |
30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1 | Bio-Rad | 1610156 | |
Ammonium persulfate | Millipore Sigma | A3678-100G | |
Benzonase nuclease | Sigma | E1014-5KU | |
Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa | GoldBio | P008-500 | |
β-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-100ML | |
Bromophenol blue | GoldBio | B-092-25 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 | MP Biomedicals LLC | 821616 | |
D-Glucose | Millipore Sigma | G8270-1KG | |
D-Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | SLBT9686 | |
Glacial Acetic acid | Millipore Sigma | ARK2183-1L | |
Glycerol, 99% | Sigma-Aldrich | G5516-1L | |
Glycine | GoldBio | G-630-1 | |
Hydrochloric acid, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 320331-2.5L | |
Isopropanol (2-Propanol) | Sigma | 402893-2.5L | |
LB broth (Miller) | Millipore Sigma | L3522-1KG | |
LB broth with agar (Miller) | Millipore Sigma | L2897-1KG | |
Lysozyme | GoldBio | L-040-25 | |
10x MOPS Buffer | Teknova | M2101 | |
Nonidet P-40 | Thomas Scientific | 9036-19-5 | |
Potassium phosphate, dibasic | Sigma-Aldrich | P3786-1KG | |
Potassium phosphate, monobasic | Acros Organics | 7778-77-0 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Millipore Sigma | T9281-50ML | |
Thiamine | Sigma-Aldrich | T4625-100G | |
100% Trichloroacetic acid | Millipore Sigma | T6399-100G | |
Tris base | GoldBio | T-400-1 | |
Material/Equipment | |||
Centrifuge tubes (15 mL) | Alkali Scientific | JABG-1019 | |
Erlenmeyer flask (125 mL) | Carolina | 726686 | |
Erlenmeyer flask (500 mL) | Carolina | 726694 | |
Freezer: -80 °C | Fisher Scientific | ||
Glass beads (0.5 mm) | BioSpec Products | 1107-9105 | |
Microcentrifuge | Hermle | Z216MK | |
Microcentriguge tubes (1.7 mL) | VWR International | 87003-294 | |
Microcentriguge tubes (2.0 mL) | Axygen Maxiclear Microtubes | MCT-200-C | |
Plastic cuvettes | Fischer Scientific | 14-377-012 | |
Power supply | ThermoFisher Scientific | EC105 | |
Rocker | Alkali Scientific | RS7235 | |
Shaking incubator (37 °C) | Benchmark Scientific | ||
Small glass plate | Bio-Rad | 1653311 | |
Spacer plates (1 mm) | Bio-Rad | 1653308 | |
Spectrophotometer | Thermoscientific | 3339053 | |
Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes | Beckman-Coulter | ||
Vertical gel electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1658004 | |
Vortexer | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 | |
Thermomixer | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
10 well comb | Bio-Rad | 1653359 |