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암 연구학

Iniezione di vena porta di organoidi del cancro del colon-retto per studiare le metastasi epatiche Stroma

Published: September 03, 2021
doi:
10.3791/62630
, , , , , , , , , , , , , , , ,
1Adelaide Medical School,University of Adelaide, 2South Australian Health and Medical Research Institute (SAHMRI), 3Department of Pathology,Nagoya University Graduate School of Medicine, 4Division of Molecular Pathology, Center for Neurological Disease and Cancer,Nagoya University Graduate School of Medicine, 5Department of Gastroenterology, Graduate School of Medicine,The University of Tokyo, 6Translational and Clinical Research Institute,Newcastle University, 7International Center for Cell and Gene Therapy,Fujita Health University

Summary

L’iniezione della vena porta di organoidi del cancro del colon-retto (CRC) genera metastasi epatiche ricche di stroma. Questo modello murino di metastasi epatiche CRC rappresenta uno strumento utile per studiare le interazioni tumore-stroma e sviluppare nuove terapie dirette dallo stroma come le terapie geniche mediate da virus adeno-associate.

Abstract

Le metastasi epatiche del cancro del colon-retto (CRC) sono una delle principali cause di morte correlata al cancro. I fibroblasti associati al cancro (CAS), un componente importante del microambiente tumorale, svolgono un ruolo cruciale nella progressione del CRC metastatico e predicono una prognosi sfavorevole del paziente. Tuttavia, vi è una mancanza di modelli murini soddisfacenti per studiare la diafonia tra cellule tumorali metastatiche e CAF. Qui, presentiamo un metodo per indagare su come la progressione delle metastasi epatiche è regolata dalla nicchia metastatica e possibilmente potrebbe essere limitata dalla terapia diretta dallo stroma. L’iniezione della vena porta di organoidi CRC ha generato una reazione desmoplastica, che ha ricapitolato fedelmente l’istologia ricca di fibroblasti delle metastasi epatiche CRC umane. Questo modello era tessuto-specifico con un carico tumorale più elevato nel fegato rispetto a un modello di iniezione intra-splenica, semplificando le analisi di sopravvivenza del topo. Iniettando organoidi tumorali che esprimono luciferasi, la cinetica di crescita tumorale potrebbe essere monitorata mediante imaging in vivo . Inoltre, questo modello preclinico fornisce una piattaforma utile per valutare l’efficacia delle terapie mirate al mesenchima tumorale. Descriviamo i metodi per esaminare se la consegna mediata da virus adeno-associati di un gene stromale che inibisce il tumore agli epatociti potrebbe rimodellare il microambiente tumorale e migliorare la sopravvivenza del topo. Questo approccio consente lo sviluppo e la valutazione di nuove strategie terapeutiche per inibire le metastasi epatiche del CRC.

Introduction

Il cancro del colon-retto (CRC) è una delle principali cause di mortalità per cancro in tutto il mondo1. Più della metà dei pazienti con CRC sviluppa metastasi epatiche che si verificano attraverso la disseminazione della vena porta1. Attualmente, non ci sono terapie efficaci in grado di curare metastasi epatiche avanzate e la maggior parte dei pazienti soccombe alla malattia metastatica.

La nicchia metastatica o il microambiente tumorale svolge un ruolo chiave nell’attecchimento e nella crescita delle cellule CRC disseminate2. I fibroblasti associati al cancro (CAS), un componente importante del microambiente tumorale, promuovono o frenano la progressione del cancro attraverso la secrezione di fattori di crescita, il rimodellamento della matrice extracellulare (ECM) e la modulazione dei paesaggi immunitari e dell’angiogenesi 3,4,5. I CAF conferiscono anche resistenza alle chemioterapie e alle immunoterapie3. Inoltre, i CAS regolano l’inizio e la progressione delle metastasi epatiche CRC e predicono la prognosi nei pazienti con CRC 3,6,7,8. Pertanto, i fattori correlati alla CAF potrebbero essere sfruttati per lo sviluppo di strategie terapeutiche per inibire le metastasi epatiche CRC. Tuttavia, la mancanza di modelli murini soddisfacenti per studiare lo stroma tumorale metastatico è stato un grosso ostacolo allo sviluppo di terapie mirate allo stroma.

Attualmente, i modelli animali per studiare le metastasi epatiche CRC includono modelli CRC primari che sviluppano spontaneamente metastasi epatiche e modelli di trapianto di cellule tumorali nel fegato. I modelli murini CRC primari, come i modelli murini geneticamente modificati e l’iniezione del colon di cellule tumorali, raramente mostrano metastasi al fegato 9,10,11,12. Inoltre, anche se si osserva una metastasi epatica, questi modelli mostrano una lunga latenza dall’induzione del tumore primario alle metastasi e potenzialmente muoiono di carico tumorale primario12. Per generare in modo efficiente metastasi epatiche CRC, le cellule CRC coltivate vengono trapiantate nel fegato utilizzando tre approcci di iniezione: iniezione intra-splenica, iniezione intra-parenchimale diretta nel fegato e iniezione della vena porta. Le cellule tumorali iniettate per via intraschiena si diffondono nella vena splenica, nella vena porta e, infine, nel fegato13,14. Tuttavia, l’iniezione intra-splenica produce un rapporto di assunzione del tumore inferiore rispetto ad altri modelli di trapianto15,16. Con l’iniezione intra-splenica, la rimozione chirurgica della milza viene eseguita per evitare la crescita del cancro nella milza, che può potenzialmente compromettere la maturazione delle cellule immunitarie17. Inoltre, l’iniezione intra-splenica può anche provocare una crescita tumorale involontaria nella milza e nella cavità addominale18, complicando le analisi delle metastasi epatiche. L’iniezione intra-parenchimale diretta nel fegato induce efficacemente metastasi epatiche 16,19,20. Tuttavia, questo approccio non ricapitola completamente una fase biologica delle metastasi epatiche che si verifica naturalmente attraverso la diffusione della vena porta. Utilizzando l’iniezione diretta nel fegato, l’ingresso di cellule tumorali in un non-portale, ma la circolazione sistemica può anche provocare più metastasi polmonari di grandi dimensioni16. Sebbene la maggior parte dei pazienti con metastasi epatiche CRC mostri più noduli tumorali nel fegato21, l’iniezione diretta in un lobo epatico specifico genera una singola massa tumorale 19,20. L’iniezione della vena porta o l’iniezione della vena mesenterica, sebbene tecnicamente impegnativa, consente una consegna efficiente delle cellule tumorali nel fegato in un modo che ricapitola i modelli di crescita osservati nei pazienti17. Questa strategia può ridurre al minimo la possibilità di metastasi secondarie e consente una rapida crescita delle cellule tumorali nel fegato, semplificando le analisi di sopravvivenza dei topi.

Storicamente, le linee cellulari del cancro del colon-retto come MC-38 di topo, HT-29 umano e SW-620 sono state utilizzate per generare modelli murini di metastasi epatiche22,23. Tuttavia, queste linee cellulari di cancro del colon-retto non inducono una reazione stromale desmoplastica. Il basso contenuto stromale nei tumori rende difficile indagare i ruoli biologici dei fibroblasti associati al cancro. I recenti progressi negli organoidi CRC e nel loro trapianto hanno offerto piattaforme utili per valutare i ruoli vitali dello stroma nella progressione del cancro24. Il trapianto di fegato di organoidi CRC genera un microambiente tumorale ricco di fibroblasti e ha fornito nuove informazioni sulla ricerca stromale 6,25. Attualmente, l’iniezione di organoidi della vena portale o mesenterica è diventata un approccio gold standard per generare metastasiepatiche CRC 6,25,26,27,28. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, nessun documento precedente ha descritto metodi dettagliati per l’iniezione della vena porta di tumoroidi del colon-retto. Qui, presentiamo una metodologia per l’utilizzo dell’iniezione della vena porta di organoidi CRC per sviluppare una nuova terapia diretta dallo stroma mediata da virus adeno-associato (AAV).

Gli epatociti sono un importante costituente del microambiente tumorale metastatico nel fegato e svolgono un ruolo fondamentale nella progressione del cancro metastatico29. Ispirati dal successo degli approcci di terapia genica AAV per indurre l’espressione proteica negli epatociti in pazienti non neoplastici30,31, abbiamo studiato un approccio simile ma volto a modificare il microambiente tumorale del fegato in CRC25. Come tale, descriviamo anche qui l’iniezione della vena della coda di AAV8 per indurre l’espressione di proteine antitumorali per modificare il microambiente tumorale del fegato. Il sierotipo AAV8, designato dalla scelta della proteina del capside virale durante la produzione del virus, porta ad un’elevata efficienza di trasduzione in particolare degli epatociti (cioè l’espressione genica mirata nel microambiente tumorale del fegato)32. Abbiamo precedentemente dimostrato che Islr (superfamiglia di immunoglobuline contenente ripetizione ricca di leucina) è un gene specifico del CAF che induce la segnalazione della proteina morfogenetica ossea (BMP), riduce la crescita dei tumori del CRC e promuove la differenziazione delle cellule staminali intestinali Lgr5+ 25. Abbiamo testato se la sovraespressione mediata da AAV8 del gene stromale che trattiene il cancro, Islr, negli epatociti potesse attenuare la progressione delle metastasi epatiche eseguendo l’iniezione della vena porta di tumori CRC in topi trattati con AAV8-Islr.

In questo articolo, descriviamo prima la procedura di iniezione della vena della coda dell’AAV tropico epatico. Quindi, descriviamo un metodo per la preparazione delle cellule tumorali e l’iniezione della vena porta nei topi trattati con AAV. Infine, presentiamo approcci per monitorare la progressione del tumore metastatico per valutare l’efficacia delle terapie dirette dallo stroma.

Protocol

Tutte le procedure animali in questo articolo sono state esaminate e approvate dal Comitato etico animale del South Australian Health and Medical Research Institute (numero di approvazione, SAM322). 1. Iniezione della vena della coda del virus adeno-associato NOTA: il virus adeno-associato (AAV) deve essere trattato come un rischio biologico secondo le linee guida di livello 1 per la biosicurezza. Si prega di fare riferimento al protocollo pubblicato per la preparazio…

Representative Results

Per indurre la sovraespressione mediata da AAV di un gene stromale che trattiene il tumore, Islr 4,25,43,44, negli epatociti, abbiamo iniettato per via endovenosa Islr-encoding AAV8. 1,0 x 1011 genomi virali (vg) di AAV8-Islr, o come controllo, AAV8-mRuby2, è stato iniettato nella vena della coda del topo adulto (Figura 1A).<e…

Discussion

In questo studio, abbiamo dimostrato che l’iniezione della vena porta di organoidi CRC di topo genera in modo riproducibile metastasi epatiche ricche di fibroblasti che imitano le caratteristiche istologiche delle metastasi epatiche CRC umane. Inoltre, se combinato con terapie dirette dallo stroma come la terapia genica mediata da AAV8, questo modello preclinico funge da strumento utile per valutare gli effetti terapeutici sulla sopravvivenza del topo e sulla crescita del tumore.

Ci sono, alme…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato supportato da sovvenzioni del National Health and Medical Research Council (APP1156391 a D.L.W., S.L.W.) (APP1081852 a D.L.W., APP1140236 a S.L.W., APP1099283 a D.L.W.,); Cancer Council SA Beat Cancer Project per conto dei suoi donatori e del governo statale dell’Australia meridionale attraverso il Dipartimento della Salute (MCF0418 to S.L.W., D.L.W.); una sovvenzione in aiuto per la ricerca scientifica (B) (20H03467 a M.T.) commissionata dal Ministero dell’Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia del Giappone; AMED-CREST (Japan Agency for Medical Research and Development, Core Research for Evolutional Science and Technology (19gm0810007h0104 e 19gm1210008s0101 to A.E.); il Project for Cancer Research and Therapeutic Evolution (P-CREATE) da AMED (19cm0106332h0002 a A.E.); Japan Society for the Promotion of Science Overseas Challenge Program for Young Researchers (a H.K.), Takeda Science Foundation Fellowship (a H.K.), Greaton International Ph.D. Scholarship (a H.K.), Lions Medical Research Foundation Scholarship (a K.G.).

Ringraziamo il Dr. Leszek Lisowski presso vector and genome Engineering Facility (VGEF), Children’s Medical Research Institute (CMRI) (NSW, AUSTRALIA) per la produzione di vettori AAV ricombinanti.

Materials

10% Formalin Sigma HT501128
15 mL centrifuge tube Corning 430791
33-gauge needle TSK LDS-33013 For portal vein injection
4-0 vicryl suture ETHICON J494G
40-µm cell strainer Corning 431750
5 mL Syringe BD 302130 Used to apply saline to the intestine after portal vein injection
50 mL centrifuge tube Corning 430829
50 mL syringe TERUMO SS*50LE Luer lock syringe for perfusion fixation
70% Isopropyl alcohol wipe Briemar 5730
Anaesthesia machine Darvall 9356
αSMA antibody DAKO M0851 Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry
Buprenorphine TROY N/A ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine
Cotton buds Johnson & Johnson N/A Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use.
D-luciferin Biosynth L-8220
Electric shaver Sold by multiple suppliers
Forceps Sold by multiple suppliers
Hamilton syringe HAMILTON 81020 For portal vein injection
Heat box (animal warming chamber) Datesand MK3
Heat lamp Sold by multiple suppliers
Hemostatic sponge Pfizer 09-0891-04-015 Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm
India ink Talens 44727000
Injection syringe and needle BD 326769 For tail vein injection
Islr probe (RNAscope) ACD 450041
Isoflurane Henry Schein 988-3244
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Perkin Elmer 124262
Living Image Software Perkin Elmer 128113
Matrigel Corning 356231
MRI fibrosis tool N/A N/A https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma D8537
RNAscope kit ACD 322300
Rodent restrainer Sold by multiple suppliers
Rosa26-Cas9 mouse The Jackson Laboratory 024858
Saline Pfizer PHA19042010
Scissors Sold by multiple suppliers
Skin staplers Able Scientific AS59028 9 mm wound clips
Stapler applicator Able Scientific AS59026 9 mm wound clip applicator
Stapler remover Able Scientific AS59037 Wound clip remover
Surgical drape Multigate 29-220
Surgical gauze Sentry Medical GS001
Topical anesthesia cream EMLA N/A EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine
TrypLE Express Gibco 12605028 Recombinant cell-dissociation enzyme mix
Y-27632 Tocris 1254
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