Portalveninjektion av kolorektal cancer (CRC) organoider genererar stromarik levermetastas. Denna musmodell av CRC-levermetastaser representerar ett användbart verktyg för att studera tumör-stroma-interaktioner och utveckla nya stroma-riktade terapier såsom adenoassocierade virusmedierade genterapier.
Levermetastasering av kolorektal cancer (CRC) är en ledande orsak till cancerrelaterad död. Cancerassocierade fibroblaster (CAF), en viktig del av tumörmikromiljön, spelar en avgörande roll i metastatisk CRC-progression och förutsäger dålig patientprognos. Det saknas dock tillfredsställande musmodeller för att studera överhörningen mellan metastatiska cancerceller och CAF. Här presenterar vi en metod för att undersöka hur levermetastasprogressionen regleras av den metastatiska nischen och eventuellt kan begränsas av stroma-riktad terapi. Portalveninjektion av CRC-organoider genererade en desmoplastisk reaktion, som troget rekapitulerade den fibroblastrika histologin hos humana CRC-levermetastaser. Denna modell var vävnadsspecifik med en högre tumörbörda i levern jämfört med en intra-mjältinjektionsmodell, vilket förenklade musöverlevnadsanalyser. Genom att injicera luciferasuttryckande tumörorganoider kunde tumörtillväxtkinetiken övervakas genom in vivo-avbildning . Dessutom ger denna prekliniska modell en användbar plattform för att bedöma effekten av terapier riktade mot tumörmesenkymet. Vi beskriver metoder för att undersöka om adenoassocierad virusmedierad leverans av en tumörhämmande stromalegen till hepatocyter skulle kunna omforma tumörmikromiljön och förbättra musens överlevnad. Detta tillvägagångssätt möjliggör utveckling och bedömning av nya terapeutiska strategier för att hämma levermetastasering av CRC.
Kolorektal cancer (CRC) är en viktig orsak till cancerdödlighet över hela världen1. Mer än hälften av CRC-patienterna utvecklar levermetastaser som sker genomportalvenspridningen 1. För närvarande finns det inga effektiva terapier som kan bota avancerad levermetastas, och de flesta patienter ger efter för metastatisk sjukdom.
Den metastatiska nischen eller tumörmikromiljön spelar en nyckelroll i engraftment och tillväxt av spridda CRC-celler2. Cancerassocierade fibroblaster (CAF), en framträdande komponent i tumörmikromiljön, främjar eller begränsar cancerprogression genom att utsöndra tillväxtfaktorer, ombygga den extracellulära matrisen (ECM) och modulera immunlandskap och angiogenes 3,4,5. CAF ger också resistens mot kemoterapier och immunterapier3. Dessutom reglerar CAF initiering och progression av CRC-levermetastaser och förutsäger prognos hos patienter med CRC 3,6,7,8. Således kan CAF-relaterade faktorer utnyttjas för utveckling av terapeutiska strategier för att hämma CRC-levermetastasering. Bristen på tillfredsställande musmodeller för att studera den metastatiska tumörstroma har dock varit ett stort hinder för att utveckla stroma-riktade terapier.
För närvarande inkluderar djurmodeller för att studera CRC-levermetastaser primära CRC-modeller som spontant utvecklar levermetastaser och cancercellstransplantationsmodeller i levern. Primära CRC-musmodeller, såsom genetiskt konstruerade musmodeller och koloninjektion av cancerceller, visar sällan metastaser till levern 9,10,11,12. Dessutom, även om en levermetastas observeras, visar dessa modeller lång latens från den primära tumörinduktionen till metastasering och dör potentiellt av primär tumörbörda12. För att effektivt generera CRC-levermetastaser transplanteras odlade CRC-celler i levern med hjälp av tre injektionsmetoder: intra-mjältinjektion, direkt intraparenkymisk injektion i levern och portalveninjektion. Intra-spleniskt injicerade cancerceller sprids i mjältvenen, portalvenen och slutligen till levern13,14. Den intra-mjältinjektion ger emellertid ett lägre tumörintagsförhållande jämfört med andra transplantationsmodeller15,16. Med intra-mjältinjektion utförs kirurgiskt avlägsnande av mjälten för att undvika cancertillväxt i mjälten, vilket potentiellt kan äventyra immuncellsmognad17. Vidare kan intra-mjältinjektion också resultera i oavsiktlig tumörtillväxt i mjälten och bukhålan18, vilket komplicerar analyser av levermetastaser. Direkt intraparenkymisk injektion i levern inducerar effektivt levermetastasering 16,19,20. Ändå rekapitulerar detta tillvägagångssätt inte helt ett biologiskt steg av levermetastas som naturligt sker genom portalvenspridning. Med hjälp av direkt injektion i levern kan cancerceller komma in i en icke-portal, men systemisk cirkulation kan också resultera i flera stora lungmetastaser16. Även om en majoritet av patienterna med CRC-levermetastaser visar flera tumörknölar i levern21, genererar direkt injektion i en specifik leverlob en enda tumörmassa19,20. Portalveninjektion eller mesenterisk veninjektion, även om det är tekniskt utmanande, möjliggör effektiv leverans av tumörceller i levern på ett sätt som sammanfattar de tillväxtmönster som ses hos patienter17. Denna strategi kan minimera risken för metastaser på sekundär plats och möjliggör snabb tillväxt av cancerceller i levern, vilket förenklar musöverlevnadsanalyser.
Historiskt sett användes kolorektal cancercellinjer som mus MC-38, human HT-29 och SW-620 för att generera musmodeller av levermetastas22,23. Dessa kolorektala cancercellinjer inducerar emellertid inte en desmoplastisk stromalreaktion. Lågt stromalinnehåll i tumörerna gör det svårt att undersöka de biologiska rollerna hos cancerassocierade fibroblaster. De senaste framstegen inom CRC-organoider och deras transplantation har erbjudit användbara plattformar för att bedöma stromas vitala roller i cancerprogression24. Levertransplantation av CRC-organoider genererar en fibroblastrik tumörmikromiljö och har gett nya insikter i stromalforskning 6,25. För närvarande har portal- eller mesenterisk veninjektion av organoider blivit en guldstandardmetod för att generera CRC-levermetastaser 6,25,26,27,28. Såvitt vi vet har dock inga tidigare artiklar beskrivit detaljerade metoder för portalveninjektion av kolorektala tumöroider. Här presenterar vi en metod för att använda portalveninjektion av CRC-organoider för att utveckla nytt adenoassocierat virus (AAV) -medieterad stroma-riktad terapi.
Hepatocyter är en viktig beståndsdel i den metastaserande tumörmikromiljön i levern och spelar en avgörande roll i metastatisk cancerprogression29. Inspirerade av framgången med AAV-genterapimetoder för att inducera proteinuttryck i hepatocyter hos icke-neoplastiska patienter30,31, undersökte vi ett liknande tillvägagångssätt men syftade till att modifiera levertumörmikromiljön i CRC25. Som sådan beskriver vi också här svansveninjektionen av AAV8 för att inducera uttryck av antitumörigena proteiner för att modifiera levertumörens mikromiljö. AAV8-serotypen, betecknad genom valet av viralt kapsidprotein under virusproduktion, leder till hög transduktionseffektivitet specifikt för hepatocyter (dvs. riktat genuttryck i levertumörmikromiljön)32. Vi har tidigare visat att Islr (immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat) är en CAF-specifik gen som inducerar benmorfogenetiskt protein (BMP) signalering, minskar CRC-tumöroidtillväxt och främjar Lgr5+ intestinal stamcellsdifferentiering25. Vi testade om AAV8-medierat överuttryck av den cancerhämtande stromagenen, Islr, i hepatocyter kunde dämpa levermetastasprogressionen genom att utföra portalveninjektion av CRC-tumöroider hos AAV8-Islr-behandlade möss.
I detta dokument beskriver vi först injektionsproceduren för svansvenen i levertropiken AAV. Därefter beskriver vi en metod för tumöroidcellberedning och portalveninjektion i de AAV-behandlade mössen. Slutligen presenterar vi metoder för att övervaka metastatisk tumörprogression för att bedöma effekten av stroma-riktade terapier.
I denna studie har vi visat att portalveninjektion av mus CRC-organoider reproducerbart genererar fibroblastrika levermetastaser som efterliknar histologiska egenskaper hos humana CRC-levermetastaser. Dessutom, i kombination med stroma-riktade terapier som AAV8-medierade genterapi, fungerar denna prekliniska modell som ett användbart verktyg för att bedöma terapeutiska effekter på musöverlevnad och tumörtillväxt.
Det finns åtminstone två kritiska steg i protokollet. För det första ?…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av bidrag från National Health and Medical Research Council (APP1156391 till D.L.W., S.L.W.) (APP1081852 till D.L.W., APP1140236 till S.L.W., APP1099283 till D.L.W.,); Cancer Council SA Beat Cancer Project på uppdrag av sina givare och delstatsregeringen i södra Australien genom Department of Health (MCF0418 till S.L.W., D.L.W.); ett bidrag till vetenskaplig forskning (B) (20H03467 till M.T.) på uppdrag av Japans ministerium för utbildning, kultur, idrott, vetenskap och teknik; AMED-CREST (Japan Agency for Medical Research and Development, Core Research for Evolutional Science and Technology (19gm0810007h0104 och 19gm1210008s0101 till A.E.); projektet för cancerforskning och terapeutisk evolution (P-CREATE) från AMED (19cm0106332h0002 till A.E.); Japan Society for the Promotion of Science Overseas Challenge Program for Young Researchers (till H.K.), Takeda Science Foundation Fellowship (till H.K.), Greaton International Ph.D. Scholarship (till H.K.), Lions Medical Research Foundation Scholarship (till K.G.).
Vi tackar Dr. Leszek Lisowski vid Vector and Genome Engineering Facility (VGEF), Children’s Medical Research Institute (CMRI) (NSW, AUSTRALIA) för att producera rekombinanta AAV-vektorer.
10% Formalin | Sigma | HT501128 | |
15 mL centrifuge tube | Corning | 430791 | |
33-gauge needle | TSK | LDS-33013 | For portal vein injection |
4-0 vicryl suture | ETHICON | J494G | |
40-µm cell strainer | Corning | 431750 | |
5 mL Syringe | BD | 302130 | Used to apply saline to the intestine after portal vein injection |
50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
50 mL syringe | TERUMO | SS*50LE | Luer lock syringe for perfusion fixation |
70% Isopropyl alcohol wipe | Briemar | 5730 | |
Anaesthesia machine | Darvall | 9356 | |
αSMA antibody | DAKO | M0851 | Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry |
Buprenorphine | TROY | N/A | ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine |
Cotton buds | Johnson & Johnson | N/A | Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use. |
D-luciferin | Biosynth | L-8220 | |
Electric shaver | Sold by multiple suppliers | ||
Forceps | Sold by multiple suppliers | ||
Hamilton syringe | HAMILTON | 81020 | For portal vein injection |
Heat box (animal warming chamber) | Datesand | MK3 | |
Heat lamp | Sold by multiple suppliers | ||
Hemostatic sponge | Pfizer | 09-0891-04-015 | Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm |
India ink | Talens | 44727000 | |
Injection syringe and needle | BD | 326769 | For tail vein injection |
Islr probe (RNAscope) | ACD | 450041 | |
Isoflurane | Henry Schein | 988-3244 | |
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
Living Image Software | Perkin Elmer | 128113 | |
Matrigel | Corning | 356231 | |
MRI fibrosis tool | N/A | N/A | https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
RNAscope kit | ACD | 322300 | |
Rodent restrainer | Sold by multiple suppliers | ||
Rosa26-Cas9 mouse | The Jackson Laboratory | 024858 | |
Saline | Pfizer | PHA19042010 | |
Scissors | Sold by multiple suppliers | ||
Skin staplers | Able Scientific | AS59028 | 9 mm wound clips |
Stapler applicator | Able Scientific | AS59026 | 9 mm wound clip applicator |
Stapler remover | Able Scientific | AS59037 | Wound clip remover |
Surgical drape | Multigate | 29-220 | |
Surgical gauze | Sentry Medical | GS001 | |
Topical anesthesia cream | EMLA | N/A | EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine |
TrypLE Express | Gibco | 12605028 | Recombinant cell-dissociation enzyme mix |
Y-27632 | Tocris | 1254 |