肝転移間質を研究するための結腸直腸癌オルガノイドの門脈注入
Summary
結腸直腸癌(CRC)オルガノイドの門脈注入は、間質に富む肝転移を生じる。CRC肝転移のこのマウスモデルは、腫瘍間質相互作用を研究し、アデノ随伴ウイルス媒介遺伝子治療などの新規間質指向性治療薬を開発するための有用なツールである。
Abstract
結腸直腸癌(CRC)の肝転移は、癌関連死の主要な原因である。腫瘍微小環境の主要成分であるがん関連線維芽細胞(CAF)は、転移性CRCの進行に重要な役割を果たし、患者の予後不良を予測します。しかしながら、転移性癌細胞とCAFとの間のクロストークを研究するための満足のいくマウスモデルが不足している。ここでは、肝転移の進行が転移ニッチによってどのように調節され、間質指向性治療によって抑制される可能性があるかを調べる方法を提示する。CRCオルガノイドの門脈注入はデスモプラスティック反応を生じ、ヒトCRC肝転移の線維芽細胞に富む組織像を忠実に再現した。このモデルは、脾臓内注射モデルと比較して肝臓の腫瘍量が高い組織特異的であり、マウスの生存率解析を簡素化した。ルシフェラーゼ発現腫瘍オルガノイドを注入することにより、腫瘍増殖動態を in vivo イメージングによってモニターすることができた。さらに、この前臨床モデルは、腫瘍間葉系を標的とする治療薬の有効性を評価するための有用なプラットフォームを提供する。我々は、アデノ随伴ウイルス媒介性腫瘍阻害間質遺伝子の肝細胞への送達が腫瘍微小環境を再構築し、マウスの生存率を改善できるかどうかを調べる方法について説明する。このアプローチは、CRCの肝転移を阻害するための新規治療戦略の開発および評価を可能にする。
Introduction
結腸直腸癌(CRC)は、世界中の癌死亡率の主要な原因である1。CRC患者の半数以上が門脈播種1を介して起こる肝転移を発症する。現在、進行した肝転移を治すことができる有効な治療法はなく、ほとんどの患者は転移性疾患に屈する。
転移性ニッチまたは腫瘍微小環境は、播種性CRC細胞2の生着および増殖において重要な役割を果たす。腫瘍微小環境の顕著な構成要素である癌関連線維芽細胞(CAF)は、増殖因子の分泌、細胞外マトリックス(ECM)のリモデリング、免疫ランドスケープおよび血管新生の調節を通じて癌の進行を促進または抑制する3、4、5。CAFはまた、化学療法および免疫療法に対する耐性を付与する3.さらに、CAFはCRC肝転移の開始および進行を調節し、CRC3、6、7、8患者の予後を予測する。したがって、CAF関連因子は、CRC肝転移を阻害する治療戦略の開発のために利用され得る。しかしながら、転移性腫瘍間質を研究するための満足のいくマウスモデルの欠如は、間質標的療法を開発する上で大きな障害となってきた。
現在、CRC肝転移を研究する動物モデルには、肝臓への肝転移を自発的に発症する原発性CRCモデルおよび癌細胞移植モデルが含まれる。遺伝子操作されたマウスモデルおよび癌細胞の結腸注射などの初代CRCマウスモデルは、肝臓への転移をめったに示さない9、10、11、12。さらに、肝転移が観察されたとしても、これらのモデルは原発性腫瘍誘導から転移までの潜伏時間が長く、原発性腫瘍量で死亡する可能性がある12。CRC肝転移を効率的に生成するために、培養したCRC細胞を、脾臓内注射、肝臓への直接実質内注射、門脈注射の3つの注射アプローチを用いて肝臓に移植する。脾臓内注射された癌細胞は、脾静脈、門脈、そして最終的には肝臓に広がった13、14。しかしながら、脾臓内注射は、他の移植モデルと比較して低い腫瘍採取比をもたらす15、16。脾臓内注射では、脾臓における癌の増殖を避けるために脾臓の外科的除去が行われ、これは潜在的に免疫細胞成熟を損なう可能性がある17。さらに、脾臓内注射はまた、脾臓および腹腔18において意図しない腫瘍増殖をもたらし得、肝転移分析を複雑にする。肝臓への直接実質内注射は、効率的に肝転移を誘導する16、19、20。それにもかかわらず、このアプローチは、門脈播種を介して自然に起こる肝転移の生物学的ステップを完全には再現しない。肝臓への直接注射を用いて、癌細胞の非門脈への侵入、しかし全身循環はまた、複数の大きな肺転移をもたらし得る16。CRC肝転移を有する患者の大多数は肝臓21に複数の腫瘍結節を示すが、特定の肝葉への直接注射は単一の腫瘍塊19、20を生成する。門脈注射または腸間膜静脈注射は、技術的には困難であるが、患者17において見られる成長パターンを反復する様式で肝臓への腫瘍細胞の効率的な送達を可能にする。この戦略は、二次部位転移の可能性を最小限に抑え、肝臓における癌細胞の急速な増殖を可能にし、マウスの生存率分析を簡素化する。
歴史的に、マウスMC-38、ヒトHT-29、およびSW-620などの結腸直腸癌細胞株は、肝転移22、23のマウスモデルを作製するために使用されていた。しかしながら、これらの結腸直腸癌細胞株は、デスモプラスティック間質反応を誘導しない。腫瘍中の間質含有量が低いと、がん関連線維芽細胞の生物学的役割を調べることが困難になります。CRCオルガノイドとその移植における最近の進歩は、がんの進行における間質の重要な役割を評価するための有用なプラットフォームを提供している24。CRCオルガノイドの肝移植は、線維芽細胞に富む腫瘍微小環境を生成し、間質研究に新たな洞察を提供してきた6,25。現在、オルガノイドの門脈または腸間膜静脈注射は、CRC肝転移を発生させるためのゴールドスタンダードアプローチとなっている6、25、26、27、28。それにもかかわらず、我々の知る限り、結腸直腸腫瘍イドの門脈注入のための詳細な方法を記載した以前の論文はない。ここでは、CRCオルガノイドの門脈注入を用いて、新規アデノ随伴ウイルス(AAV)媒介間質指向療法を開発するための方法論を提示する。
肝細胞は、肝臓における転移性腫瘍微小環境の重要な構成要素であり、転移性癌の進行において重要な役割を果たす29。非腫瘍性患者30、31の肝細胞におけるタンパク質発現を誘導するAAV遺伝子治療アプローチの成功に触発され、我々は同様のアプローチを調査したが、CRC25における肝腫瘍微小環境を改変することを目指した。そのようにして、我々はまた、肝腫瘍微小環境を改変する抗腫瘍化タンパク質の発現を誘導するAAV8の尾静脈注射を本明細書に記載する。ウイルス産生中のウイルス性カプシドタンパク質の選択によって指定されるAAV8血清型は、肝細胞の特異的な高い形質導入効率(すなわち、肝腫瘍微小環境における標的遺伝子発現)をもたらす32。我々は以前、Islr(ロイシンリッチリピートを含む免疫グロブリンスーパーファミリー)が、骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達を誘導し、CRC腫瘍様増殖を減少させ、Lgr5+腸幹細胞分化を促進するCAF特異的遺伝子であることを示した25。我々は、AAV8-Islr治療マウスにおいてCRC腫瘍イドの門脈注射を行うことによって、肝細胞における癌抑制間質遺伝子IslrのAAV8媒介性過剰発現が肝転移進行を減弱させることができるかどうかを試験した。
本稿では、まず肝熱帯性AAVの尾静脈注射手順について説明する。次に、AAV処理マウスへの腫瘍様細胞調製および門脈注入の方法について説明する。最後に、間質指向性治療薬の有効性を評価するために転移性腫瘍の進行をモニターするためのアプローチを提示する。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、マウスCRCオルガノイドの門脈注射が、ヒトCRC肝転移の組織学的特徴を模倣した線維芽細胞に富む肝転移を再現性よく生成することを示した。さらに、AAV8媒介性遺伝子治療などの間質指向性治療薬と組み合わせると、この前臨床モデルは、マウスの生存および腫瘍増殖に対する治療効果を評価するための有用なツールとして役立つ。
プロトコルには、少なく?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、National Health and Medical Research Council(APP1156391からD.L.W.、S.L.W.)からの助成金によって支援された。(APP1081852からD.L.W.、APP1140236からS.L.W.、APP1099283からD.L.W.、);Cancer Council SA Beat Cancer Projectは、保健省を通じてドナーと南オーストラリア州政府を代表して(MCF0418からS.L.W.、D.L.W.へ)。文部科学省委託科学研究費補助金(基盤研究(B)(20H03467~M.T.)AMED-CREST(独立行政法人日本医療研究開発機構 進化科学技術基盤研究(19gm0810007h0104、19gm1210008s0101~A.E.)、AMEDからがん研究・治療進化プロジェクト(P-CREATE)(19cm0106332h0002~A.E.);日本学術振興会若手研究者海外チャレンジプログラム(所在日)、武田科学財団フェローシップ(所英)、グリートン国際博士課程奨学金(所在日)、ライオンズ医学研究財団奨学金(弊社)
我々は、組換えAAVベクターを作製したChildren’s Medical Research Institute (CMRI) (NSW, AUSTRALIA) のVector and Genome Engineering Facility(VGEF)のLeszek Lisowski博士に感謝する。
Materials
| 10% Formalin | Sigma | HT501128 | |
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 33-gauge needle | TSK | LDS-33013 | For portal vein injection |
| 4-0 vicryl suture | ETHICON | J494G | |
| 40-µm cell strainer | Corning | 431750 | |
| 5 mL Syringe | BD | 302130 | Used to apply saline to the intestine after portal vein injection |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 50 mL syringe | TERUMO | SS*50LE | Luer lock syringe for perfusion fixation |
| 70% Isopropyl alcohol wipe | Briemar | 5730 | |
| Anaesthesia machine | Darvall | 9356 | |
| αSMA antibody | DAKO | M0851 | Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry |
| Buprenorphine | TROY | N/A | ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine |
| Cotton buds | Johnson & Johnson | N/A | Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use. |
| D-luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| Electric shaver | Sold by multiple suppliers | ||
| Forceps | Sold by multiple suppliers | ||
| Hamilton syringe | HAMILTON | 81020 | For portal vein injection |
| Heat box (animal warming chamber) | Datesand | MK3 | |
| Heat lamp | Sold by multiple suppliers | ||
| Hemostatic sponge | Pfizer | 09-0891-04-015 | Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm |
| India ink | Talens | 44727000 | |
| Injection syringe and needle | BD | 326769 | For tail vein injection |
| Islr probe (RNAscope) | ACD | 450041 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3244 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software | Perkin Elmer | 128113 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| MRI fibrosis tool | N/A | N/A | https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| RNAscope kit | ACD | 322300 | |
| Rodent restrainer | Sold by multiple suppliers | ||
| Rosa26-Cas9 mouse | The Jackson Laboratory | 024858 | |
| Saline | Pfizer | PHA19042010 | |
| Scissors | Sold by multiple suppliers | ||
| Skin staplers | Able Scientific | AS59028 | 9 mm wound clips |
| Stapler applicator | Able Scientific | AS59026 | 9 mm wound clip applicator |
| Stapler remover | Able Scientific | AS59037 | Wound clip remover |
| Surgical drape | Multigate | 29-220 | |
| Surgical gauze | Sentry Medical | GS001 | |
| Topical anesthesia cream | EMLA | N/A | EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine |
| TrypLE Express | Gibco | 12605028 | Recombinant cell-dissociation enzyme mix |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
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