Portal Injeção de Veia de Organoides de Câncer Colorretal para Estudar o Estroma metástase hepática

Summary

A injeção de veia portal de organoides de câncer colorretal (CRC) gera metástase hepática rica em estroma. Este modelo de camundongos de metástase hepática crc representa uma ferramenta útil para estudar interações tumorais-estroma e desenvolver novas terapêuticas dirigidas a estroma, como terapias genéticas mediadas por vírus associados ao adeno.

Abstract

A metástase hepática do câncer colorretal (CRC) é uma das principais causas de morte relacionada ao câncer. Os fibroblastos associados ao câncer (CAFs), um dos principais componentes do microambiente tumoral, desempenham um papel crucial na progressão metastática do CRC e predizem um prognóstico ruim do paciente. No entanto, há falta de modelos satisfatórios de camundongos para estudar o crosstalk entre células cancerígenas metastáticas e CAFs. Aqui, apresentamos um método para investigar como a progressão da metástase hepática é regulada pelo nicho metastático e possivelmente poderia ser contida pela terapia dirigida por estroma. A injeção de veia portal de organoides crc gerou uma reação desmoplástica, que recapitulou fielmente a histologia rica em fibroblasto de metástases hepáticas crc humanas. Este modelo foi específico do tecido com maior carga tumoral no fígado quando comparado a um modelo de injeção intra-esplênica, simplificando as análises de sobrevivência do camundongo. Ao injetar organoides tumorais que expressam luciferase, a cinética de crescimento tumoral poderia ser monitorada por imagens in vivo . Além disso, este modelo pré-clínico fornece uma plataforma útil para avaliar a eficácia da terapêutica voltada para o mesenquime tumoral. Descrevemos métodos para examinar se a entrega mediada por vírus adeno de um gene estromal inibidor de tumores para hepatócitos poderia remodelar o microambiente tumoral e melhorar a sobrevivência do camundongo. Essa abordagem permite o desenvolvimento e a avaliação de novas estratégias terapêuticas para inibir a metástase hepática do CRC.

Introduction

O câncer colorretal (CRC) é uma das principais causas de mortalidade por câncer em todo o mundo¹. Mais da metade dos pacientes do CRC desenvolve metástase hepática que ocorre através da disseminação venosa^{do portal 1}. Atualmente, não há terapêuticas eficazes que possam curar metástase hepática avançada, e a maioria dos pacientes sucumbe à doença metastática.

O nicho metastático ou microambiente tumoral desempenha um papel fundamental no enenxermento e crescimento das células CRC disseminadas². Os fibroblastos associados ao câncer (CAFs), um componente proeminente do microambiente tumoral, promovem ou restringem a progressão do câncer através de fatores de crescimento secretos, remodelação da matriz extracelular (ECM) e modulação de paisagens imunes e angiogênese ^3,4,5. Os CAFs também conferem resistência às quimioterapias e imunoterápicos³. Além disso, os CAFs regulam a iniciação e progressão da metástase hepática do CRC e prevêem prognóstico em pacientes com C CRC 3,6,7,8. Assim, fatores relacionados ao CAF poderiam ser explorados para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para inibir a metástase hepática do CRC. No entanto, a falta de modelos satisfatórios de camundongos para estudar o estromoma tumoral metastático tem sido um grande obstáculo para o desenvolvimento de terapias direcionadas ao estroma.

Atualmente, modelos animais para estudar metástase hepática crc incluem modelos primários de CRC que desenvolvem espontaneamente modelos de metástase hepática e transplante de células cancerosas no fígado. Modelos primários de camundongos CRC, como modelos de camundongos geneticamente modificados e injeção cólon de células cancerosas, raramente apresentam metástase no fígado 9,10,11,12. Além disso, mesmo que seja observada uma metástase hepática, esses modelos mostram longa latência desde a indução do tumor primário até a metástase, e potencialmente morrem de carga tumoral primária¹². Para gerar eficientemente metástases hepáticas crc, células de CRC cultivadas são transplantadas no fígado usando três abordagens de injeção: injeção intra-esplênica, injeção intra-parenchímal direta no fígado e injeção de veia portal. Células cancerígenas injetadas intra-esplenticamente se espalharam pela veia esplênica, a veia portal, e, finalmente, para o fígado^13,14. No entanto, a injeção intra-esplênica produz uma menor relação de dor tumoral em comparação com outros modelos de transplante^15,16. Com injeção intra-esplênica, a remoção cirúrgica do baço é realizada para evitar o crescimento do câncer no baço, o que pode comprometer potencialmente a maturação das células imunes¹⁷. Além disso, a injeção intra-esplênica também pode resultar em crescimento tumoral não intencional no baço e cavidade abdominal¹⁸, complicando as análises de metástase hepática. A injeção intra-pareínrima direta no fígado induz eficientemente a metástase hepática 16,19,20. No entanto, essa abordagem não recapitula totalmente um passo biológico de metástase hepática que ocorre naturalmente através da disseminação da veia portal. Usando injeção direta no fígado, a entrada de células cancerígenas em um não-portal, mas a circulação sistêmica também pode resultar em múltiplas metástases pulmonares^{grandes 16}. Embora a maioria dos pacientes com metástase hepática CRC apresentem nódulos tumorais múltiplos no fígado²¹, a injeção direta em um lobo hepático específico gera uma única massa tumoral^19,20. A injeção de veia portal ou injeção de veia mesentérico, embora tecnicamente desafiadora, permite a entrega eficiente de células tumorais no fígado de forma a recapitular os padrões de crescimento vistos em pacientes¹⁷. Essa estratégia pode minimizar a possibilidade de metástases de local secundário e permite o rápido crescimento de células cancerígenas no fígado, simplificando as análises de sobrevivência do camundongo.

Historicamente, linhas de células cancerígenas colorretais como o mouse MC-38, o HT-29 humano e o SW-620 foram usadas para gerar modelos de camundongos de metástase hepática^22,23. No entanto, essas linhas de células cancerígenas colorretais não induzem uma reação escromato desmoplástica. O baixo teor estroma nos tumores dificulta a investigação dos papéis biológicos dos fibroblastos associados ao câncer. Os recentes avanços nos organoides de CRC e seus transplantes têm oferecido plataformas úteis para avaliar papéis vitais do estroma na progressão^{do câncer 24}. O transplante de fígado de organoides CRC gera um microambiente tumoral rico em fibroblasto e forneceu novas informações sobre a pesquisa estromal ^6,25. Atualmente, a injeção de veias mesentóricas de organoides tornou-se uma abordagem padrão-ouro para gerar metástase hepática CRC 6,25,26,27,28. No entanto, pelo que sabemos, nenhum trabalho anterior descreveu métodos detalhados para a injeção venosa portal de tumoróides colorretais. Aqui, apresentamos uma metodologia para o uso da injeção venosa portal de organoides CRC para desenvolver uma nova terapia orientada a adeno -mediada pelo estromoma ..

Os hepatócitos são um importante constituinte do microambiente tumoral metastático no fígado e desempenham um papel crítico na progressão do câncer metastático²⁹. Inspirados pelo sucesso das abordagens da terapia genética AAV para induzir a expressão proteica em hepatocitos em pacientes não neoplásicos^30,31, investigamos uma abordagem semelhante, mas que visava modificar o microambiente do tumor hepático no CRC²⁵. Como tal, também descrevemos aqui a injeção da veia da cauda do AAV8 para induzir a expressão de proteínas anti-tumorigênicas para modificar o microambiente tumoral hepático. O sorotipo AAV8, designado pela escolha da proteína capsida viral durante a produção do vírus, leva à alta eficiência de transdução especificamente dos hepatócitos (ou seja, expressão genética direcionada no microambiente do tumor hepático)³². Já mostramos anteriormente que islr (superfamília imunoglobulina contendo repetição rica em leucina) é um gene específico da CAF que induz a sinalização de proteína morfogenética óssea (BMP), reduz o crescimento tumoróide do CRC e promove a diferenciação de células-tronco intestinais Lgr5⁺²⁵. Testamos se a superexpressão mediada pelo AAV8 do gene estromal que restringe o câncer, Islr, em hepatócitos poderia atenuar a progressão da metástase hepática realizando a injeção de veia portal de tumoróides CRC em camundongos tratados com AAV8-Islr.

Neste artigo, descrevemos primeiro o procedimento de injeção da veia da cauda do AAV trópico hepático. Em seguida, descrevemos um método de preparação de células tumoróides e injeção de veia portal nos camundongos tratados com AAV. Por fim, apresentamos abordagens para monitorar a progressão do tumor metastático para avaliar a eficácia da terapêutica dirigida ao estroma.

Protocol

Todos os procedimentos animais deste artigo foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Instituto de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália do Sul (número de aprovação, SAM322). 1. Injeção de veia de cauda do vírus associado ao adeno NOTA: O vírus associado ao Adeno (AAV) deve ser tratado como um risco biológico sob as diretrizes de Nível 1 de Biossegurança. Consulte o protocolo publicado para preparação, purificação e titulação<sup c…

Representative Results

Para induzir a superexpressão mediada pelo AAV de um gene escroto de contenção de tumores, Islr 4,25,43,44, em hepatócitos, injetamos intravenosamente AAV8 codificadora de Islr. 1.0 x 1011 genomas virais (vg) de AAV8-Islr, ou como controle, AAV8-mRuby2, foi injetado na veia da cauda do rato adulto (Figura 1A). Duas…

Discussion

Neste estudo, mostramos que a injeção de veia portal de organoides de CRC do camundongo gera reproduzivelmente metástases hepáticas ricas em fibroblastos que imitam características histológicas de metástases hepáticas crc humanas. Além disso, quando combinado com terapêuticas dirigidas ao estroma, como a terapia genética mediada pelo AAV8, este modelo pré-clínico serve como uma ferramenta útil para avaliar os efeitos terapêuticos sobre a sobrevivência do camundongo e o crescimento do tumor.

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Materials

10% Formalin	Sigma	HT501128
15 mL centrifuge tube	Corning	430791
33-gauge needle	TSK	LDS-33013	For portal vein injection
4-0 vicryl suture	ETHICON	J494G
40-µm cell strainer	Corning	431750
5 mL Syringe	BD	302130	Used to apply saline to the intestine after portal vein injection
50 mL centrifuge tube	Corning	430829
50 mL syringe	TERUMO	SS*50LE	Luer lock syringe for perfusion fixation
70% Isopropyl alcohol wipe	Briemar	5730
Anaesthesia machine	Darvall	9356
αSMA antibody	DAKO	M0851	Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry
Buprenorphine	TROY	N/A	ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine
Cotton buds	Johnson & Johnson	N/A	Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use.
D-luciferin	Biosynth	L-8220
Electric shaver			Sold by multiple suppliers
Forceps			Sold by multiple suppliers
Hamilton syringe	HAMILTON	81020	For portal vein injection
Heat box (animal warming chamber)	Datesand	MK3
Heat lamp			Sold by multiple suppliers
Hemostatic sponge	Pfizer	09-0891-04-015	Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm
India ink	Talens	44727000
Injection syringe and needle	BD	326769	For tail vein injection
Islr probe (RNAscope)	ACD	450041
Isoflurane	Henry Schein	988-3244
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	124262
Living Image Software	Perkin Elmer	128113
Matrigel	Corning	356231
MRI fibrosis tool	N/A	N/A	https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	D8537
RNAscope kit	ACD	322300
Rodent restrainer			Sold by multiple suppliers
Rosa26-Cas9 mouse	The Jackson Laboratory	024858
Saline	Pfizer	PHA19042010
Scissors			Sold by multiple suppliers
Skin staplers	Able Scientific	AS59028	9 mm wound clips
Stapler applicator	Able Scientific	AS59026	9 mm wound clip applicator
Stapler remover	Able Scientific	AS59037	Wound clip remover
Surgical drape	Multigate	29-220
Surgical gauze	Sentry Medical	GS001
Topical anesthesia cream	EMLA	N/A	EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine
TrypLE Express	Gibco	12605028	Recombinant cell-dissociation enzyme mix
Y-27632	Tocris	1254