Implantation d’une fenêtre crânienne pour l’imagerie in vivo répétée chez des souris éveillées
Summary
Présenté ici est un protocole pour l’implantation d’une fenêtre crânienne chronique pour l’imagerie longitudinale des cellules du cerveau chez des souris éveillées et retenues par la tête.
Abstract
Pour bien comprendre la physiologie cellulaire des neurones et de la glie chez les animaux qui se comportent, il est nécessaire de visualiser leur morphologie et d’enregistrer leur activité in vivo chez les souris qui se comportent. Cet article décrit une méthode d’implantation d’une fenêtre crânienne chronique pour permettre l’imagerie longitudinale des cellules cérébrales chez des souris éveillées et retenues par la tête. En combinaison avec des stratégies génétiques et des injections virales, il est possible de marquer des cellules et des régions d’intérêt spécifiques avec des marqueurs structurels ou physiologiques. Ce protocole montre comment combiner des injections virales pour marquer les neurones à proximité des astrocytes exprimant GCaMP6 dans le cortex pour l’imagerie simultanée des deux cellules à travers une fenêtre crânienne. L’imagerie multiphotonique des mêmes cellules peut être effectuée pendant des jours, des semaines ou des mois chez des animaux éveillés et se comportant. Cette approche fournit aux chercheurs une méthode pour visualiser la dynamique cellulaire en temps réel et peut être appliquée pour répondre à un certain nombre de questions en neurosciences.
Introduction
La capacité d’effectuer une microscopie à fluorescence multiphotonique in vivo dans le cortex de souris est primordiale pour l’étude de la signalisation cellulaire et de la structure 1,2,3,4,5,6,7,8,9, de la pathologie de la maladie 10,11 et du développement cellulaire12,13 . Avec l’implantation de fenêtres crâniennes chroniques, l’imagerie longitudinale est possible, permettant une imagerie répétée des zones corticales pendant des jours, des semaines oudes mois 13,14 chez des animaux vivants. La microscopie multiphotonique est idéale pour l’imagerie in vivo et répétée en raison de l’amélioration du sondage en profondeur et de la réduction des photodommages associés au laser infrarouge utilisé. Cela permet d’étudier la dynamique moléculaire et cellulaire de cellules spécifiques dans diverses régions corticales.
La microscopie multiphotonique a été utilisée pour l’imagerie in vivo de cellules neuronales et gliales chez des souris 15,16,17,18,19,20. Diverses stratégies peuvent être mises en œuvre pour étiqueter des types de cellules et des domaines d’intérêt particuliers. Une approche courante consiste à stimuler l’expression de protéines fluorescentes génétiquement codées d’une manière spécifique à la cellule en utilisant le système de recombinaison Cre-Lox. Cela peut être effectué avec des souris génétiquement modifiées, par exemple en croisant une souris tdTomato « floxed » (Ai14) avec une souris exprimant la Cre-recombinase sous un promoteur d’intérêt21. Alternativement, le marquage spécifique aux cellules et au site peut être réalisé avec des injections virales. Ici, un virus codant pour la Cre recombinase sous un promoteur spécifique à la cellule et un virus codant pour un gène floxé d’intérêt sont injectés dans une région définie. Les types de cellules appropriés recevant les deux vecteurs viraux exprimeront alors le(s) gène(s) souhaité(s). Ces gènes peuvent être des marqueurs structurels, tels que tdTomato, pour visualiser les changements dans la morphologie cellulaire22 ou des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECI), tels que GCaMP et / ou RCaMP, pour examiner la dynamiquedu calcium 23. Les méthodes de recombinaison génétique peuvent être appliquées individuellement ou en combinaison pour marquer un ou plusieurs types de cellules. Une troisième approche, ne nécessitant pas de souris transgéniques ou de constructions virales (qui ont une capacité d’emballage limitée), consiste à électroporation in utero des constructions d’ADN24. Selon le moment de l’électroporation, différents types de cellules peuvent être ciblés 25,26,27.
Lors de l’imagerie multiphotonique, les souris peuvent être imagées alors qu’elles sont éveillées ou anesthésiées. L’imagerie des souris éveillées peut être réalisée en sécurisant la souris via une plaque de tête attachée28. Cette approche est rendue moins stressante en permettant un mouvement relativement libre de l’animal à l’aide de méthodes, telles que des balles en polystyrène flottant librement et soutenues par air29, des tapis roulants flottantlibrement 1 ou un système de cage domestique soulevé par air où les souris sont fixées par une plaque de tête attachée et autorisées à se déplacer dans une chambre ouverte30. Pour chacune de ces conditions d’imagerie, il sera d’abord nécessaire d’habituer les souris à la configuration d’imagerie. Cet article décrit la procédure d’accoutumance et d’imagerie à l’aide d’un système de cage domestique soulevé par air.
Ce protocole décrit l’implantation d’une fenêtre crânienne chronique pour l’imagerie longitudinale in vivo dans le cortex. Ici, nous utiliserons des souris qui expriment conditionnellement GCaMP6f dans les astrocytes pour surveiller la dynamique de signalisation du calcium. En outre, cet article décrit la procédure pour les injections virales en utilisant tdTomato comme étiquette pour les neurones. Cela permet de déterminer les changements dans la structure synaptique neuronale et / ou la disponibilité en tant que marqueur structurel permettant l’imagerie répétée du même astrocyte. Tout au long du protocole, des étapes cruciales seront mises en évidence pour assurer la meilleure qualité possible des images obtenues à partir de la microscopie multiphotonique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons présenté un protocole pour l’implantation de fenêtres crâniennes chroniques pour l’imagerie in vivo d’astrocytes corticaux et de neurones chez des souris éveillées et retenues sur une cage domestique soulevée par air. Des exemples spécifiques ont été fournis de l’application de la fenêtre crânienne pour l’imagerie des astrocytes qui expriment les GECI et les structures synaptiques neuronales. Avec l’utilisation de la microscopie multiphotonique, la dynamique de signalisati…
Materials
| 15o Pointed Blade | Surgistar | 6500 | Surgery Tools |
| 19 G Needles | BD | 305186 | Surgery Supply |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Viral Vector |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Viral Vector |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagent |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Surgery Supply |
| Beveler | Narishige | Equipment | |
| Borosilicate Glass | World Precision Instruments | TW100F-4 | Surgery Supply |
| Carbide Burs | SS White Dental | 14717 | Surgery Tools |
| Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Compressed Air | Fisher Scientific | 23-022-523 | Surgery Supply |
| Cotton Tip Applicators | Puritan | 836-WC NO BINDER | Surgery Supply |
| Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Surgery Supply |
| Dental Drill | Aseptico | Equipment | |
| Dexamethasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Dissecting Microscope | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (dental cement liquid) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagent |
| Duralay Powder (dental cement powder) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagent |
| Enrofloxacin, 2.27% | Bayer | Drug | |
| Eye Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Surgery Supply |
| Fiber Lite High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Equipment | |
| Forceps (Large) | World Precision Instruments | 14099 | Surgery Tools |
| Forceps (Small) | World Precision Instruments | 501764 | Surgery Tools |
| GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Mouse line |
| Germinator | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Mouse Line |
| Headplate | Neurotar | Model 1, Model 3 | Surgery Supply |
| Hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501705 | Surgery Tools |
| Holder for 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | 501247 | Surgery Tools |
| Holder for Scalpel Blades | World Precision Instruments | 500236 | Surgery Tools |
| Iodine Prep Pads | Avantor | 15648-926 | Surgery Supply |
| Isoflurane | Piramal | Surgery Supply | |
| Isoflurane table top system with Induction Box | Harvard Apparatus | Equipment | |
| Isoflurane Vaporizer | SurgiVet | Equipment | |
| Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reagent |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | fast-curing instant adhesive |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cyanoacrylate adhesive gel |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Equipment | |
| Multiphoton Microscope | Equipment | ||
| Nitrogen | Matheson | NI M200 | Gas |
| Oxygen | Matheson | OX M250 | Gas |
| Picospritzer | Parker | intracellular microinjection dispense system | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
| Rodent Hair Trimmer | Wahl | Equipment | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
| Scalpel Blades, Size 11 | Integra | 4-111 | Surgery Tools |
| Scissors | World Precision Instruments | 503667 | Surgery Tools |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Equipment | |
| Sugi Sponge Strips (sponge strips) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
| SURGIFOAM (gel foam) | Ethicon | 1972 | Surgery Supply |
| Syringe with 26 G Needle | BD | 309625 | Surgery Supply |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagent |
| Ti:Sapphire Laser | Coherent | Equipment | |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Surgery Supply |
| Water Blanket | Fisher Scientific | Equipment | |
| Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL | Fresenius Kabi USA | Drug |
References
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