覚醒マウスにおける 反復生体内 イメージングのための頭蓋窓の移植
Summary
ここに提示されるのは、覚醒した頭部拘束マウスにおける脳細胞の縦方向イメージングのための慢性頭蓋窓の移植のためのプロトコルである。
Abstract
行動する動物におけるニューロンおよびグリアの細胞生理機能を完全に理解するためには、それらの形態を視覚化し、行動するマウス における生体内で のそれらの活性を記録する必要がある。この論文では、覚醒した頭部拘束マウスの脳細胞の縦方向イメージングを可能にするために、慢性頭蓋窓を移植する方法について説明する。遺伝的戦略およびウイルス注射と組み合わせて、特定の細胞および関心のある領域を構造的または生理学的マーカーで標識することができる。このプロトコルは、頭蓋窓を通して両方の細胞を同時にイメージングするために、皮質内のGCaMP6発現アストロサイトの近傍のニューロンを標識するためにウイルス注射を組み合わせる方法を実証する。同じ細胞の多光子イメージングは、目を覚まし、行動する動物で数日、数週間、または数ヶ月間行うことができる。このアプローチは、研究者に細胞ダイナミクスをリアルタイムで表示するための方法を提供し、神経科学における多くの質問に答えるために適用することができます。
Introduction
マウスの皮質においてin vivo多光子蛍光顕微鏡検査を行う能力は、細胞シグナル伝達および構造1、2、3、4、5、6、7、8、9、疾患病理学10、11、および細胞発生12,13の研究にとって最も重要である。.慢性頭蓋窓の移植により、縦方向の画像化が可能であり、生きた動物において皮質領域の数日、数週間、または数ヶ月13,14の反復画像化を可能にする。多光子顕微鏡は、深度プロービングの改善と使用される赤外線レーザーに関連する光損傷の低減により、in vivo、反復イメージングに最適です。これにより、様々な皮質領域における特定の細胞の分子動態および細胞動態の研究が可能になる。
多光子顕微鏡は、マウス15、16、17、18、19、20におけるニューロンおよびグリア細胞のインビボイメージングに使用されている。特定の細胞型および関心のある領域を標識するために、様々な戦略を実施することができる。1つの一般的なアプローチは、Cre-Lox組換え系を用いて、遺伝的にコードされた蛍光タンパク質の発現を細胞特異的な方法で駆動することである。これは、遺伝子改変マウスを用いて、例えば、tdTomato「フロックス」マウス(Ai14)を、目的のプロモーター21の下でCreリコンビナーゼを発現するマウスと交配させることで行うことができる。あるいは、細胞特異的および部位特異的標識は、ウイルス注射によって達成され得る。ここでは、細胞特異的プロモーター下のCreリコンビナーゼをコードするウイルスと、目的のフロックス化遺伝子をコードするウイルスとを、規定領域に注入する。両方のウイルスベクターを受け取る適切な細胞型は、所望の遺伝子を発現する。これらの遺伝子は、tdTomatoなどの構造マーカーとして、細胞形態の変化22、またはGCaMPおよび/またはRCaMPなどの遺伝的にコードされたカルシウム指標(GECI)を表示してカルシウム動態を調べることができます23。遺伝子組換えの方法は、1つ以上の細胞型を標識するために個々にまたは組み合わせて適用することができる。第3のアプローチは、トランスジェニックマウスまたはウイルス構築物(パッケージング能力が限られている)を必要としない、DNA構築物24の子宮エレクトロポレーションである。エレクトロポレーションのタイミングに応じて、異なる細胞型を標的とすることができる25、26、27。
多光子イメージングを行う場合、マウスは、覚醒中または麻酔をかけながら画像化することができる。覚醒マウスの撮像は、取り付けられたヘッドプレート28を介してマウスを固定することにより行うことができる。このアプローチは、マウスが取り付けられたヘッドプレートによって固定され、開放チャンバ30内を移動させられる、自由浮遊、空気支持発泡スチロールボール29、自由浮遊トレッドミル1、または空中吊り下げ式ホームケージシステムなどの方法を用いて、動物の比較的自由な移動を可能にすることによって、ストレスを少なくする。これらの画像化条件のそれぞれについて、まずマウスを画像化セットアップに慣れさせる必要があるであろう。本稿では、空輸式ホームケージシステムを用いた馴化とイメージングの手順について述べる。
このプロトコールは、皮質における縦方向の in vivo イメージングのための慢性頭蓋窓の移植を記載する。ここでは、アストロサイトにおいてGCaMP6fを条件付きに発現するマウスを用いて、カルシウムシグナル伝達ダイナミクスをモニターする。さらに、本稿では、tdTomatoをニューロンの標識として用いたウイルス注射の手順について述べる。これにより、ニューロンシナプス構造の変化の決定および/または同じアストロサイトの反復イメージングを可能にする構造マーカーとしての利用可能性が可能になる。プロトコル全体を通して、多光子顕微鏡から得られた画像の可能な限り最高の品質を確保するために、重要なステップが強調されます。
Protocol
すべての動物実験は、ネブラスカ大学医療センターでIACUCによって承認されたガイドラインに従って実施した。 1. 手術前 ウイルス注射用のピペットを準備する。ピペットプーラーを使用してホウケイ酸ガラス毛細血管を引っ張り、ピペットを20°の角度で面取りします。ピペットを一晩滅菌します。 滅菌ゲルフォームの新鮮な断片を小さな正方形に切断し?…
Representative Results
頭蓋窓の質は、ニューロン構造がどれほど鮮明に見えるかによって評価することができる。良い窓には、樹枝状の棘がはっきりと見えます(図1)。構造データと位置データを保存すると、同じ動物を数日、数週間、または数か月にわたって繰り返し画像化して、同じ細胞を調べることができます(図1)。 図1 の画像は、一次運動?…
Discussion
ここでは、空中持ち上げられたホームケージ上の覚醒した頭部拘束マウスにおける皮質アストロサイトおよびニューロンの in vivo イメージングのための慢性頭蓋窓の移植のためのプロトコルを提示した。GECIsおよびニューロンシナプス構造を発現するアストロサイトを画像化するための頭蓋窓アプリケーションの具体例が提供されている。多光子顕微鏡法を用いることで、アストロサ?…
Materials
| 15o Pointed Blade | Surgistar | 6500 | Surgery Tools |
| 19 G Needles | BD | 305186 | Surgery Supply |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Viral Vector |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Viral Vector |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagent |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Surgery Supply |
| Beveler | Narishige | Equipment | |
| Borosilicate Glass | World Precision Instruments | TW100F-4 | Surgery Supply |
| Carbide Burs | SS White Dental | 14717 | Surgery Tools |
| Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Compressed Air | Fisher Scientific | 23-022-523 | Surgery Supply |
| Cotton Tip Applicators | Puritan | 836-WC NO BINDER | Surgery Supply |
| Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Surgery Supply |
| Dental Drill | Aseptico | Equipment | |
| Dexamethasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Dissecting Microscope | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (dental cement liquid) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagent |
| Duralay Powder (dental cement powder) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagent |
| Enrofloxacin, 2.27% | Bayer | Drug | |
| Eye Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Surgery Supply |
| Fiber Lite High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Equipment | |
| Forceps (Large) | World Precision Instruments | 14099 | Surgery Tools |
| Forceps (Small) | World Precision Instruments | 501764 | Surgery Tools |
| GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Mouse line |
| Germinator | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Mouse Line |
| Headplate | Neurotar | Model 1, Model 3 | Surgery Supply |
| Hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501705 | Surgery Tools |
| Holder for 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | 501247 | Surgery Tools |
| Holder for Scalpel Blades | World Precision Instruments | 500236 | Surgery Tools |
| Iodine Prep Pads | Avantor | 15648-926 | Surgery Supply |
| Isoflurane | Piramal | Surgery Supply | |
| Isoflurane table top system with Induction Box | Harvard Apparatus | Equipment | |
| Isoflurane Vaporizer | SurgiVet | Equipment | |
| Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reagent |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | fast-curing instant adhesive |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cyanoacrylate adhesive gel |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Equipment | |
| Multiphoton Microscope | Equipment | ||
| Nitrogen | Matheson | NI M200 | Gas |
| Oxygen | Matheson | OX M250 | Gas |
| Picospritzer | Parker | intracellular microinjection dispense system | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
| Rodent Hair Trimmer | Wahl | Equipment | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
| Scalpel Blades, Size 11 | Integra | 4-111 | Surgery Tools |
| Scissors | World Precision Instruments | 503667 | Surgery Tools |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Equipment | |
| Sugi Sponge Strips (sponge strips) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
| SURGIFOAM (gel foam) | Ethicon | 1972 | Surgery Supply |
| Syringe with 26 G Needle | BD | 309625 | Surgery Supply |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagent |
| Ti:Sapphire Laser | Coherent | Equipment | |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Surgery Supply |
| Water Blanket | Fisher Scientific | Equipment | |
| Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL | Fresenius Kabi USA | Drug |
References
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Cite This Article
Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice. J. Vis. Exp. (172), e62633, doi:10.3791/62633 (2021).