Implantación de una ventana craneal para imágenes repetidas in vivo en ratones despiertos
Summary
Aquí se presenta un protocolo para la implantación de una ventana craneal crónica para la obtención de imágenes longitudinales de células cerebrales en ratones despiertos y con la cabeza restringida.
Abstract
Para comprender completamente la fisiología celular de las neuronas y la glía en animales que se comportan, es necesario visualizar su morfología y registrar su actividad in vivo en ratones que se comportan. Este artículo describe un método para la implantación de una ventana craneal crónica para permitir la obtención de imágenes longitudinales de células cerebrales en ratones despiertos y con la cabeza restringida. En combinación con estrategias genéticas e inyecciones virales, es posible etiquetar células y regiones específicas de interés con marcadores estructurales o fisiológicos. Este protocolo demuestra cómo combinar inyecciones virales para etiquetar neuronas en las cercanías de los astrocitos que expresan GCaMP6 en la corteza para obtener imágenes simultáneas de ambas células a través de una ventana craneal. Las imágenes multifotónicas de las mismas células se pueden realizar durante días, semanas o meses en animales despiertos y de comportamiento. Este enfoque proporciona a los investigadores un método para ver la dinámica celular en tiempo real y se puede aplicar para responder a una serie de preguntas en neurociencia.
Introduction
La capacidad de realizar microscopía de fluorescencia multifotónica in vivo en la corteza de ratones es primordial para el estudio de la señalización celular y la estructura 1,2,3,4,5,6,7,8,9, la patología de la enfermedad 10,11 y el desarrollo celular12,13 . Con la implantación de ventanas craneales crónicas, es posible la obtención de imágenes longitudinales, lo que permite la obtención repetida de imágenes de áreas corticales durante días, semanas o meses13,14 en animales vivos. La microscopía multifotónica es ideal para imágenes repetidas in vivo debido a la mejora del sondeo de profundidad y la reducción del fotodaño asociado con el láser infrarrojo utilizado. Esto permite el estudio de la dinámica molecular y celular de células específicas en varias regiones corticales.
La microscopía multifotónica se ha utilizado para la obtención de imágenes in vivo de células neuronales y gliales en ratones 15,16,17,18,19,20. Se pueden implementar varias estrategias para etiquetar tipos de células particulares y áreas de interés. Un enfoque común es impulsar la expresión de proteínas fluorescentes codificadas genéticamente de una manera específica de la célula utilizando el sistema de recombinación Cre-Lox. Esto se puede realizar con ratones modificados genéticamente, por ejemplo, cruzando tdTomato “floxed” mouse (Ai14) con un ratón que expresa Cre-recombinasa bajo un promotor de interés21. Alternativamente, el etiquetado específico de células y sitios se puede lograr con inyecciones virales. Aquí, un virus que codifica Cre recombinasa bajo un promotor específico de la célula y un virus que codifica un gen floxed de interés se inyectan en una región definida. Los tipos de células apropiadas que reciben ambos vectores virales expresarán los genes deseados. Estos genes pueden ser marcadores estructurales, como tdTomato, para ver los cambios en la morfología celular22 o indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI), como GCaMP y / o RCaMP, para examinar la dinámica del calcio23. Los métodos de recombinación genética se pueden aplicar individualmente o en combinación para etiquetar uno o más tipos de células. Un tercer enfoque, que no requiere ratones transgénicos o construcciones virales (que tienen una capacidad de empaque limitada), es la electroporación in utero de las construcciones de ADN24. Dependiendo del momento de la electroporación, se pueden apuntar a diferentes tipos decélulas 25,26,27.
Al realizar imágenes multifotónicas, los ratones pueden ser fotografiados mientras están despiertos o anestesiados. Las imágenes de ratones despiertos se pueden realizar asegurando el ratón a través de una placa de cabeza adjunta28. Este enfoque se hace menos estresante al permitir el movimiento relativamente libre del animal utilizando métodos, como bolas de espuma de poliestireno29 que flotan libremente y apoyadas en el aire, cintas de correr que flotanlibremente 1 o un sistema de jaula doméstica levantada por aire donde los ratones se sujetan con una placa de cabeza adjunta y se les permite moverse en una cámara abierta30. Para cada una de estas condiciones de imagen, primero será necesario habituar a los ratones a la configuración de imágenes. Este artículo describe el procedimiento de habituación e imágenes utilizando un sistema de jaula casera con elevación por aire.
Este protocolo describe la implantación de una ventana craneal crónica para imágenes longitudinales in vivo en la corteza. Aquí, usaremos ratones que expresan condicionalmente GCaMP6f en astrocitos para monitorear la dinámica de señalización del calcio. Además, este artículo describe el procedimiento para las inyecciones virales utilizando tdTomato como una etiqueta para las neuronas. Esto permite la determinación de cambios en la estructura sináptica neuronal y/o la disponibilidad como marcador estructural que permite la obtención de imágenes repetidas del mismo astrocito. A lo largo del protocolo, se destacarán pasos cruciales para garantizar la mejor calidad posible de las imágenes obtenidas de la microscopía multifotónica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, hemos presentado un protocolo para la implantación de ventanas craneales crónicas para imágenes in vivo de astrocitos corticales y neuronas en ratones despiertos y con la cabeza restringida en una jaula casera levantada por aire. Se han proporcionado ejemplos específicos de la aplicación de ventana craneal para imágenes de astrocitos que expresan GECI y estructuras sinápticas neuronales. Con el uso de la microscopía multifotónica, la dinámica de señalización astrocítica del calcio y la dinám…
Materials
| 15o Pointed Blade | Surgistar | 6500 | Surgery Tools |
| 19 G Needles | BD | 305186 | Surgery Supply |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Viral Vector |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Viral Vector |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagent |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Surgery Supply |
| Beveler | Narishige | Equipment | |
| Borosilicate Glass | World Precision Instruments | TW100F-4 | Surgery Supply |
| Carbide Burs | SS White Dental | 14717 | Surgery Tools |
| Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Compressed Air | Fisher Scientific | 23-022-523 | Surgery Supply |
| Cotton Tip Applicators | Puritan | 836-WC NO BINDER | Surgery Supply |
| Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Surgery Supply |
| Dental Drill | Aseptico | Equipment | |
| Dexamethasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Dissecting Microscope | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (dental cement liquid) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagent |
| Duralay Powder (dental cement powder) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagent |
| Enrofloxacin, 2.27% | Bayer | Drug | |
| Eye Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Surgery Supply |
| Fiber Lite High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Equipment | |
| Forceps (Large) | World Precision Instruments | 14099 | Surgery Tools |
| Forceps (Small) | World Precision Instruments | 501764 | Surgery Tools |
| GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Mouse line |
| Germinator | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Mouse Line |
| Headplate | Neurotar | Model 1, Model 3 | Surgery Supply |
| Hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501705 | Surgery Tools |
| Holder for 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | 501247 | Surgery Tools |
| Holder for Scalpel Blades | World Precision Instruments | 500236 | Surgery Tools |
| Iodine Prep Pads | Avantor | 15648-926 | Surgery Supply |
| Isoflurane | Piramal | Surgery Supply | |
| Isoflurane table top system with Induction Box | Harvard Apparatus | Equipment | |
| Isoflurane Vaporizer | SurgiVet | Equipment | |
| Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reagent |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | fast-curing instant adhesive |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cyanoacrylate adhesive gel |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Equipment | |
| Multiphoton Microscope | Equipment | ||
| Nitrogen | Matheson | NI M200 | Gas |
| Oxygen | Matheson | OX M250 | Gas |
| Picospritzer | Parker | intracellular microinjection dispense system | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
| Rodent Hair Trimmer | Wahl | Equipment | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
| Scalpel Blades, Size 11 | Integra | 4-111 | Surgery Tools |
| Scissors | World Precision Instruments | 503667 | Surgery Tools |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Equipment | |
| Sugi Sponge Strips (sponge strips) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
| SURGIFOAM (gel foam) | Ethicon | 1972 | Surgery Supply |
| Syringe with 26 G Needle | BD | 309625 | Surgery Supply |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagent |
| Ti:Sapphire Laser | Coherent | Equipment | |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Surgery Supply |
| Water Blanket | Fisher Scientific | Equipment | |
| Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL | Fresenius Kabi USA | Drug |
References
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