Makrofag differentiering og polarisering i en M2-lignende fænotype ved hjælp af en human monocyt-lignende THP-1 Leukæmi Cell Line
Summary
M2-lignende tumor-associerede makrofager (TAM) er forbundet med tumor progression og dårlig prognose i kræft. Denne protokol fungerer som en detaljeret guide til reproducerer differentiere og polarisere THP-1 monocyt-lignende celler i M2-lignende makrofager inden for 14 dage. Denne model er grundlaget for at undersøge de antiinflammatoriske virkninger af TAM inden for tumormikromiljøet.
Abstract
Tumor-associerede makrofager (TAM) kan skifte deres udtryk og cytokin profil i henhold til eksterne stimuli. Denne bemærkelsesværdige plasticitet gør det muligt for TAM at tilpasse sig løbende ændringer inden for tumor mikromiljø. Makrofager kan have enten primært pro-inflammatoriske (M1-lignende) eller antiinflammatoriske (M2-lignende) attributter og kan løbende skifte mellem disse to hovedstater. M2-lignende makrofager inden for tumormiljøet er forbundet med kræft progression og dårlig prognose i flere typer af kræft. Mange forskellige metoder til at fremkalde differentiering og polarisering af THP-1 celler bruges til at undersøge cellulære og intercellulære mekanismer og virkningerne af TAM inden for mikromiljøet af tumorer. I øjeblikket er der ingen etableret model for M2-lignende makrofag polarisering ved hjælp af THP-1 celle linje, og resultaterne af udtryk og cytokin profiler af makrofager på grund af visse in vitro stimuli varierer mellem undersøgelser. Denne protokol tjener som detaljeret vejledning til at differentiere THP-1 monocyt-lignende celler i M0 makrofager og yderligere polarisere celler i en M2-lignende fænotype inden for 14 dage. Vi demonstrerer de morfologiske ændringer af THP-1 monocyt-lignende celler, differentierede makrofager og polariserede M2-lignende makrofager ved hjælp af lysmikroskopi. Denne model er grundlaget for cellelinjemodeller, der undersøger de antiinflammatoriske virkninger af TAM og deres interaktioner med andre cellepopulationer af tumormikromiljøet.
Introduction
Tumor-associerede makrofager (TAM) og deres rolle i kronisk inflammation, udbrud af kræft, og tumor udvikling er vigtige mål i nyere forskning1,2. Perifere blodmonocytter, der rekrutteres til vævsmikromiljøet af den udviklende tumor, differentieres til makrofager og kan polariseres i to hovedundertyper afmakrofager 3. Den klassisk aktiverede makrofag repræsenterer den primært proinflammatoriske M1-lignende fænotype, og den alternativt aktiverede M2-lignende undertype viser overvejende antiinflammatoriske egenskaber4. Makrofager kan skifte dynamisk mellem disse to vigtigste fænotyper afhængigt af deres cellulære metabolisme, med mellemliggende undertyper, der har både inflammatoriske og antiinflammatoriske egenskaber5. TAM repræsenterer en heterogen population af begge fænotyper. En tumorfremmende funktion og dårlig prognose i forskellige typer kræftformer er dog især forbundet med M2-lignendemakrofager 6,7,8.
De funktionelle profiler af makrofager og deres interaktion med andre celler i tumormikromiljøet er komplekse og udfordrende at fange i et konstant skiftende miljø under løbende tumorudvikling. Cellelinjer kan give en homogen cellepopulation med stabil levedygtighed i kulturen, hvilket kan lette processen med at demonstrere definerede cellulære og intercellulære mekanismer. Den monocyt-lignende THP-1 celle linje er en legitim model system for primære menneskelige monocytter9. Denne spontant udødeliggjorte cellelinje er opnået fra det perifere blod fra et etårigt spædbarn med akut monocytisk leukæmi9,10. Differentiering og polarisering af BP-1-celler er blevet rapporteret af flere undersøgelser og er blevet udført på flere forskellige måder11,12,13,14. Aktivering og dermed polarisering af makrofager i en M1-lignende fænotype efterfølges af en kompenserende antiinflammatorisk rebound-mekanisme, der fremmer en M2-lignende fænotype gennem cytokiner produceret af inflammatoriske makrofager, såsom interleukin 6 (IL-6) eller itaconate15,16. Dette kan tjene som en pause mekanisme til at dæmpe en overskridelse inflammatorisk respons efter celle aktivering17. Processen med at differentiere og polarisere monocytter og THP-1 monocyt-lignende celler i en antiinflammatorisk M2-lignende fænotype ledsages også af proinflammatoriske stimuli, der skal overvindes. En inflammatorisk cytokin respons kan være forårsaget af mekanisk stress18, såsom at ændre medier til at refeede cellerne, eller tilføje kemiske forbindelser til at differentiere THP-1 celler, såsom phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA), og fremkalde produktion af tumornekrose faktor α (TNFα), interleukin 1β (IL-1β) eller IL-619. Denne ændrede cytokinudtryksprofil som svar på PMA kan påvirke og forhindre efterfølgende makrofagspolarisering20. Passende hvileperioder, som rapporteret før efter PMA-behandling, tillader disse inflammatoriske reaktioner at falde og lette celle polarisering i en særskilt M2-lignende fænotype21.
Denne protokol demonstrerer en metode til at differentiere og polarisere THP-1 monocyt-lignende celler i en M2-lignende fænotype af makrofager inden for 14 dage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol om differentiering og polarisering AF THP-1 monocytlignende celler inden for 14 dage giver en metode til at opnå makrofager med en særskilt M2-lignende fænotype på grund af lang behandling inkubation af celler med passende hvileperioder mellem trin.
Visse trin er vigtige for denne protokol. Fordoblingstiden for THP-1 monocytter er ca. 26 timer. Celler kan opdeles ved en celletæthed på 9 x 105/mL og skal sås med en massefylde på 3 x 105/mL under hver…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Price Institute of Surgical Research, University of Louisville, er økonomisk støttet af John W. Price og Barbara Thruston Atwood Price Trust. Finansieringskilderne havde ingen rolle i udformningen og gennemførelsen af undersøgelsen samt i indsamlingen, ledelsen, analysen og fortolkningen af dataene.
Materials
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | – | |
| Ethyl alcohol (70%) | – | – | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | – | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | – | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | – | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
References
- Zhang, R., et al. Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer. Cell Death and Disease. 10 (4), 273 (2019).
- Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).
- Soncin, I., et al. The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma. Nature Communications. 9 (1), 582 (2018).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. Metabolism and TAM functions-it takes two to tango. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).
- Eum, H. H., et al. Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer. Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).
- Qian, B. Z., Pollard, J. W. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis. Cell. 141 (1), 39-51 (2010).
- Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O’Brien, S. J., Galandiuk, S. Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer – how macrophages build the bridge. Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438 (2016).
- . The American Type Culture Collection (ATCC) Available from: https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation (2021)
- Baxter, E. W., et al. Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes. Journal of Immunological Methods. 478, 112721 (2020).
- Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide. BMC Cancer. 15, 577 (2015).
- Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium. PLoS One. 13 (3), 0193601 (2018).
- Lund, M. E., To, J., O’Brien, B. A., Donnelly, S. The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus. Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).
- Yin, Z., et al. IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).
- O’Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function. Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).
- Luig, M., et al. Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).
- Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. Mechanical regulation of macrophage function – cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages. Inflammation and Regeneration. 39, 3 (2019).
- Gatto, F., et al. PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles. Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).
- Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Raggi, F., et al. Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 11097 (2017).
- Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response. PLoS One. 8 (7), 69687 (2013).
- Kurashina, Y., et al. Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves. Communications Biology. 2, 393 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).
