Makrophagendifferenzierung und Polarisation in einen M2-ähnlichen Phänotyp unter Verwendung einer humanen Monozyten-ähnlichen THP-1-Leukämie-Zelllinie
Summary
M2-ähnliche tumorassoziierte Makrophagen (TAM) sind mit Tumorprogression und schlechter Prognose bei Krebs assoziiert. Dieses Protokoll dient als detaillierte Anleitung, um THP-1-Monozyten-ähnliche Zellen innerhalb von 14 Tagen reproduzierbar in M2-ähnliche Makrophagen zu differenzieren und zu polarisieren. Dieses Modell ist die Grundlage, um die entzündungshemmende Wirkung von TAM in der Tumormikroumgebung zu untersuchen.
Abstract
Tumorassoziierte Makrophagen (TAM) können ihre Expression und ihr Zytokinprofil entsprechend äußerer Reize umschalten. Diese bemerkenswerte Plastizität ermöglicht es TAM, sich an laufende Veränderungen in der Mikroumgebung des Tumors anzupassen. Makrophagen können entweder primär entzündungsfördernd (M1-ähnlich) oder entzündungshemmend (M2-ähnlich) Eigenschaften aufweisen und können kontinuierlich zwischen diesen beiden Hauptzuständen wechseln. M2-ähnliche Makrophagen innerhalb der Tumorumgebung sind mit Krebsprogression und schlechter Prognose bei verschiedenen Krebsarten verbunden. Viele verschiedene Methoden zur Induktion der Differenzierung und Polarisation von THP-1-Zellen werden verwendet, um zelluläre und interzelluläre Mechanismen und die Auswirkungen von TAM in der Mikroumgebung von Tumoren zu untersuchen. Derzeit gibt es kein etabliertes Modell für die M2-ähnliche Makrophagenpolarisation mit der THP-1-Zelllinie, und die Ergebnisse von Expressions- und Zytokinprofilen von Makrophagen aufgrund bestimmter In-vitro-Reize variieren zwischen den Studien. Dieses Protokoll dient als detaillierte Anleitung, um THP-1-Monozyten-ähnliche Zellen in M0-Makrophagen zu differenzieren und Zellen innerhalb von 14 Tagen weiter in einen M2-ähnlichen Phänotyp zu polarisieren. Wir zeigen die morphologischen Veränderungen von THP-1-Monozyten-ähnlichen Zellen, differenzierten Makrophagen und polarisierten M2-ähnlichen Makrophagen mittels Lichtmikroskopie. Dieses Modell ist die Grundlage für Zelllinienmodelle, die die entzündungshemmende Wirkung von TAM und deren Wechselwirkungen mit anderen Zellpopulationen der Tumormikroumgebung untersuchen.
Introduction
Tumorassoziierte Makrophagen (TAM) und ihre Rolle bei chronischen Entzündungen, dem Auftreten von Krebs und der Tumorentwicklung sind wichtige Ziele in der neueren Forschung1,2. Periphere Blutmonozyten, die in die Gewebemikroumgebung des sich entwickelnden Tumors rekrutiert werden, differenzieren sich zu Makrophagen und können in zwei Hauptsubtypen von Makrophagen polarisiert werden3. Der klassisch aktivierte Makrophage stellt den primär entzündungsfördernden M1-ähnlichen Phänotyp dar und der alternativ aktivierte M2-ähnliche Subtyp zeigt überwiegend entzündungshemmende Eigenschaften4. Makrophagen können dynamisch zwischen diesen beiden Hauptphänotypen wechseln, abhängig von ihrem Zellstoffwechsel, wobei intermediäre Subtypen sowohl entzündliche als auch entzündungshemmende Eigenschaftenaufweisen 5. TAM stellt eine heterogene Population beider Phänotypen dar. Eine tumorfördernde Funktion und schlechte Prognose bei verschiedenen Krebsarten ist jedoch besonders mit M2-ähnlichen Makrophagen verbunden6,7,8.
Die funktionellen Profile von Makrophagen und ihre Interaktion mit anderen Zellen innerhalb der Tumormikroumgebung sind komplex und schwierig in einer sich ständig verändernden Umgebung während der laufenden Tumorentwicklung zu erfassen. Zelllinien können eine homogene Zellpopulation mit stabiler Lebensfähigkeit in Kultur bieten, was den Prozess des Nachweises definierter zellulärer und interzellulärer Mechanismen erleichtern kann. Die monozytenartige THP-1-Zelllinie ist ein legitimes Modellsystem für primäre humane Monozyten9. Diese spontan verewigte Zelllinie wurde aus dem peripheren Blut eines einjährigen Säuglings mit akuter monozytärer Leukämie gewonnen9,10. Die Differenzierung und Polarisation von THP-1-Zellen wurde in mehreren Studien berichtet und auf verschiedene Arten durchgeführt11,12,13,14. Auf die Aktivierung und damit die Polarisation von Makrophagen in einen M1-ähnlichen Phänotyp folgt ein kompensatorischer entzündungshemmender Rebound-Mechanismus, der einen M2-ähnlichen Phänotyp durch Zytokine fördert, die von entzündlichen Makrophagen wie Interleukin 6 (IL-6) oder Itaconat15,16produziert werden. Dies könnte als Bruchmechanismus dienen, um eine überschießende Entzündungsreaktion nach Zellaktivierung abzuschwächen17. Der Prozess der Differenzierung und Polarisierung von Monozyten und THP-1-monozytenähnlichen Zellen zu einem entzündungshemmenden M2-ähnlichen Phänotyp wird selbst auch von entzündungsfördernden Reizen begleitet, die überwunden werden müssen. Eine entzündliche Zytokinreaktion kann durch mechanischen Stress18verursacht werden, z. B. durch Den Wechsel von Medien, um die Zellen zu refetieren, oder durch Zugabe chemischer Verbindungen zur Differenzierung von THP-1-Zellen, wie Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA), und induzieren die Produktion von Tumornekrosefaktor α (TNFα), Interleukin 1β (IL-1β) oder IL-619. Dieses veränderte Zytokinexpressionsprofil als Reaktion auf PMA kann die nachfolgende Makrophagenpolarisation beeinflussen und verhindern20. Ausreichende Ruhezeiten, wie zuvor nach der PMA-Behandlung berichtet, ermöglichen es diesen Entzündungsreaktionen, die Zellpolarisation in einen ausgeprägten M2-ähnlichen Phänotyp21zu verringern und zu erleichtern.
Dieses Protokoll demonstriert eine Methode, um THP-1-Monozyten-ähnliche Zellen innerhalb von 14 Tagen in einen M2-ähnlichen Phänotyp von Makrophagen zu differenzieren und zu polarisieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll zur Differenzierung und Polarisierung von THP-1-Monozyten-ähnlichen Zellen innerhalb von 14 Tagen bietet eine Methode, um Makrophagen mit einem ausgeprägten M2-ähnlichen Phänotyp aufgrund einer langen Behandlungsinkubation von Zellen mit ausreichenden Ruhezeiten zwischen den Schritten zu erhalten.
Bestimmte Schritte sind für dieses Protokoll von entscheidender Bedeutung. Die Verdopplungszeit der THP-1-Monozyten beträgt ca. 26 h. Zellen können mit einer Zelldichte von 9 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Das Price Institute of Surgical Research, University of Louisville, wird vom John W. Price and Barbara Thruston Atwood Price Trust finanziell unterstützt. Die Finanzierungsquellen spielten keine Rolle bei der Konzeption und Durchführung der Studie sowie bei der Erhebung, Verwaltung, Analyse und Interpretation der Daten.
Materials
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | – | |
| Ethyl alcohol (70%) | – | – | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | – | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | – | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | – | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
References
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