Makrofag differentiering och polarisering till en M2-liknande fenotyp med hjälp av en mänsklig monocytliknande THP-1 leukemi cellinje
Summary
M2-liknande tumör-associerade makrofager (TAM) är associerade med tumör progression och dålig prognos i cancer. Detta protokoll fungerar som en detaljerad guide för att reproducerbart skilja och polarisera THP-1 monocytliknande celler i M2-liknande makrofager inom 14 dagar. Denna modell är grunden för att undersöka de antiinflammatoriska effekterna av TAM inom tumörmikromiljön.
Abstract
Tumör-associerade makrofager (TAM) kan byta uttryck och cytokin profil enligt externa stimuli. Denna anmärkningsvärda plasticitet gör det möjligt för TAM att anpassa sig till pågående förändringar inom tumör mikromiljön. Makrofager kan ha antingen främst proinflammatoriska (M1-liknande) eller antiinflammatoriska (M2-liknande) attribut och kan kontinuerligt växla mellan dessa två huvudstater. M2-liknande makrofager i tumörmiljön är förknippade med cancerprogression och dålig prognos i flera typer av cancer. Många olika metoder för att inducera differentiering och polarisering av THP-1 celler används för att undersöka cellulära och intercellulära mekanismer och effekterna av TAM inom mikromiljön av tumörer. För närvarande finns det ingen etablerad modell för M2-liknande makrofagpolarisering med THP-1-cellinjen, och resultaten av uttrycks- och cytokinprofiler av makrofager på grund av vissa in vitro-stimuli varierar mellan studierna. Detta protokoll fungerar som detaljerad vägledning för att skilja THP-1 monocyt-liknande celler till M0 makrofager och att ytterligare polarisera celler till en M2-liknande fenotyp inom 14 dagar. Vi visar morfologiska förändringar av THP-1 monocyt-liknande celler, differentierade makrofager och polariserade M2-liknande makrofager med hjälp av lätta mikroskopi. Denna modell är grunden för cellinjemodeller som undersöker de antiinflammatoriska effekterna av TAM och deras interaktioner med andra cellpopulationer i tumörmikromiljön.
Introduction
Tumör-associerade makrofager (TAM) och deras roll i kronisk inflammation, uppkomsten av cancer och tumörutveckling är viktiga mål i ny forskning1,2. Perifera blod monocyter som rekryteras till vävnad mikromiljön av den utvecklande tumör skilja sig åt i makrofager och kan polariseras till två huvudsakliga subtyper av makrofager3. Den klassiskt aktiverade makrofaget representerar den främst proinflammatoriska M1-liknande fenotypen och den alternativt aktiverade M2-liknande subtypen visar övervägande antiinflammatoriska egenskaper4. Makrofager kan växla dynamiskt mellan dessa två huvudsakliga fenotyper beroende på deras cellulära metabolism, med mellanliggande subtyper som har både inflammatoriska och antiinflammatoriska attribut5. TAM representerar en heterogen population av båda fenotyperna. En tumörfrämjande funktion och dålig prognos i olika typer av cancer är dock särskilt förknippad med M2-liknande makrofager6,7,8.
De funktionella profilerna för makrofager och deras interaktion med andra celler i tumörmikromiljön är komplexa och utmanande att fånga i en ständigt föränderlig miljö under pågående tumörutveckling. Cellinjer kan ge en homogen cellpopulation stabil livskraft i kulturen, vilket kan underlätta processen att demonstrera definierade cellulära och intercellulära mekanismer. Den monocytliknande THP-1-cellinjen är ett legitimt modellsystem för primära mänskliga monocyter9. Denna spontant odödliga cellinje har erhållits från perifert blod av ett ettårigt spädbarn med akut monocytisk leukemi9,10. Differentiering och polarisering av THP-1 celler har rapporterats av flera studier och har utförts på flera olika sätt11,12,13,14. Aktivering och därmed polarisering av makrofager till en M1-liknande fenotyp följs av en kompensatorisk antiinflammatorisk rebound-mekanism, som främjar en M2-liknande fenotyp genom cytokiner som produceras av inflammatoriska makrofager, såsom interleukin 6 (IL-6) eller itakonat15,16. Detta kan fungera som en brytmekanism för att dämpa ett översnynde inflammatoriskt svar efter cellaktivering17. Processen att differentiera och polarisera monocyter och THP-1 monocytliknande celler till en antiinflammatorisk M2-liknande fenotyp åtföljs också av proinflammatoriska stimuli som måste övervinnas. Ett inflammatoriskt cytokinsvar kan orsakas av mekanisk stress18, såsom att byta media för att mata cellerna, eller lägga till kemiska föreningar för att skilja THP-1-celler, såsom phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA), och inducera produktion av tumörnekrosfaktor α (TNFα), interleukin 1β (IL-1β) eller IL-619. Denna ändrade cytokin uttryck profil som ett svar på PMA kan påverka och förhindra efterföljande makrofag polarisering20. Adekvata viloperioder, som rapporterats före efter PMA behandling, tillåter dessa inflammatoriska svar att minska och underlätta cellpolarisering till en distinkt M2-liknande fenotyp21.
Detta protokoll visar en metod för att differentiera och polarisera THP-1 monocyt-liknande celler i en M2-liknande fenotyp av makrofager inom 14 dagar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll om differentiering och polariserande THP-1 monocyt-liknande celler inom 14 dagar ger en metod för att erhålla makrofager med en distinkt M2-liknande fenotyp på grund av lång behandling inkubation av celler med tillräckliga viloperioder mellan steg.
Vissa steg är viktiga för det här protokollet. Fördubblingstiden för THP-1 monocyter är cirka 26 timmar. Cellerna kan delas med en celltäthet på 9 x 105/ml och ska sås med en densitet på 3 x 105/m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Price Institute of Surgical Research, University of Louisville, stöds ekonomiskt av John W. Price och Barbara Thruston Atwood Price Trust. Finansieringskällorna hade ingen roll i studiens utformning och genomförande samt i insamling, förvaltning, analys och tolkning av uppgifterna.
Materials
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | – | |
| Ethyl alcohol (70%) | – | – | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | – | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | – | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | – | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
References
- Zhang, R., et al. Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer. Cell Death and Disease. 10 (4), 273 (2019).
- Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).
- Soncin, I., et al. The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma. Nature Communications. 9 (1), 582 (2018).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. Metabolism and TAM functions-it takes two to tango. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).
- Eum, H. H., et al. Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer. Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).
- Qian, B. Z., Pollard, J. W. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis. Cell. 141 (1), 39-51 (2010).
- Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O’Brien, S. J., Galandiuk, S. Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer – how macrophages build the bridge. Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438 (2016).
- . The American Type Culture Collection (ATCC) Available from: https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation (2021)
- Baxter, E. W., et al. Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes. Journal of Immunological Methods. 478, 112721 (2020).
- Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide. BMC Cancer. 15, 577 (2015).
- Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium. PLoS One. 13 (3), 0193601 (2018).
- Lund, M. E., To, J., O’Brien, B. A., Donnelly, S. The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus. Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).
- Yin, Z., et al. IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).
- O’Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function. Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).
- Luig, M., et al. Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).
- Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. Mechanical regulation of macrophage function – cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages. Inflammation and Regeneration. 39, 3 (2019).
- Gatto, F., et al. PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles. Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).
- Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Raggi, F., et al. Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 11097 (2017).
- Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response. PLoS One. 8 (7), 69687 (2013).
- Kurashina, Y., et al. Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves. Communications Biology. 2, 393 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).
