Summary
Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em células funcionais semelhantes a hepatócitos (HLCs) complementando continuamente a Activina A e CHIR99021 durante a diferenciação do HESC em endóderme definitivo (DE).
Abstract
As funções potenciais das células semelhantes a hepatócitos (HLCs) derivadas de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) têm grande promessa para modelagem de doenças e aplicações de rastreamento de medicamentos. Fornecido aqui é um método eficiente e reprodutível para diferenciação de hESCs em HLCs funcionais. O estabelecimento de uma linhagem de endoderm é um passo fundamental na diferenciação para os HLCs. Pelo nosso método, regulamos as principais vias de sinalização, suplementando continuamente a Activina A e CHIR99021 durante a diferenciação do HESC em endóderme definitivo (DE), seguido pela geração de células progenitoras hepáticas, e finalmente HLCs com morfologia hepatocitada típica em um método de estágio com reagentes completamente definidos. Os HLCs derivados do hESC produzidos por este método expressam marcadores específicos de palco (incluindo albumina, O receptor nuclear HNF4α e o polipeptídeo de cotransportamento de sódio (NTCP) e apresentam características especiais relacionadas a hepatócitos maduros e funcionais (incluindo coloração verde indocitana, armazenamento de glicogênio, coloração de hematoxilina-eosina e atividade CYP3), e pode fornecer uma plataforma para o desenvolvimento de aplicações baseadas em HLC no estudo de doenças hepáticas.
Introduction
O fígado é um órgão altamente metabólico que desempenha vários papéis, incluindo desoxidação, armazenamento de glicogênio, e secreção e síntese de proteínas1. Vários patógenos, drogas e herediidade podem causar alterações patológicas no fígado e afetar suas funções2,3. Os hepatócitos, como a principal unidade funcional do fígado, desempenham um papel importante nos sistemas de apoio hepático artificial e na eliminação da toxicidade medicamentosa. No entanto, o recurso dos hepatócitos humanos primários é limitado na terapia baseada em células, bem como na pesquisa de doenças hepáticas. Portanto, desenvolver novas fontes de hepatócitos humanos funcionais é uma importante direção de pesquisa no campo da medicina regenerativa. Desde 1998, quando foram estabelecidos4,os hESCs têm sido amplamente considerados pelos pesquisadores devido ao seu potencial de diferenciação superior (eles podem se diferenciar em vários tecidos em um ambiente adequado) e alto grau de autoconexibilidade, e assim fornecer células de origem ideais para fígados bioartificial, transplante de hepatocito e até mesmo engenharia de tecido hepático5.
Atualmente, a eficiência de diferenciação hepática pode ser muito aumentada enriquecendo o endodermo6. Na diferenciação de linhagem das células-tronco em endoderme, os níveis do fator de crescimento transformador β (TGF-β) sinalização e vias de sinalização WNT são os fatores-chave no nó do estágio de formação do endoderme. A ativação de um alto nível de sinalização TGF-β e WNT pode promover o desenvolvimento do endodermo7,8. Activin A é uma citocina pertencente à superfamília TGF-β. Portanto, a Activin A é amplamente utilizada na indução de endoderme de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) e hESCs9,10. GSK3 é uma proteína de serina-threonina quinase. Pesquisadores descobriram que o CHIR99021, um inibidor específico do GSK3β, pode estimular sinais típicos de WNT, e pode promover a diferenciação de células-tronco sob certas condições, sugerindo que o CHIR99021 tem potencial para induzir a diferenciação de células-tronco no endóderme 11,12,13.
Aqui relatamos um método eficiente e reprodutível para induzir efetivamente a diferenciação dos hESCs em HLCs funcionais. A adição sequencial de Activin A e CHIR99021 produziu cerca de 89,7±0,8% de células SOX17 (marcador DE)positivos. Após serem ainda mais maturadas in vitro,essas células expressaram marcadores específicos hepáticos e exerceram morfologia semelhante a hepatocito (baseada na coloração de hematoxilina-eosina (H & E)) e funções, como absorção de verde indociina (ICG), armazenamento de glicogênio e atividade CYP3. Os resultados mostram que os hESCs podem ser diferenciados com sucesso em HLCs funcionais maduros por este método e podem fornecer uma base para pesquisas relacionadas a doenças hepáticas e triagem de medicamentos in vitro.
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Protocol
1. Manutenção de células-tronco
NOTA: O protocolo de manutenção celular descrito abaixo se aplica à linha de células hES03 mantida em uma monocamada aderente. Para todos os protocolos a seguir neste manuscrito, as células devem ser manuseadas sob um gabinete de segurança biológica.
- Prepare o meio de cultura de células-tronco 1x mTesR diluindo 5x meio suplementar para mTesR meio básico.
- Prepare o meio Matrigel qualificado em 30x hESC diluindo 5 mL de Matrigel qualificado pelo HESC com 5 mL de DMEM/F12 no gelo. Armazenar a -20 °C.
- Prepare 1x hESC-qualificado meio Matrigel diluindo 33,3 μL de 30x hESC qualificado Matrigel com 1 mL de DMEM/F12.
- Cubra o poço estéril 6, placas tratadas com cultura tecidual com 1 mL de Matrigel qualificado 1x hESC em cada poço com antecedência e armazene a 4 °C durante a noite. Deixe em temperatura ambiente (RT) por pelo menos 30 minutos antes de usar.
- Descongele os hESCs criopreservados em um banho de água de 37 °C por 3 min sem tremer. Em seguida, transfira imediatamente as células pipetando para um tubo de centrífugas de 15 mL contendo 4 mL prewarmed 37 °C mTesR médio, pipet para cima e para baixo suavemente 2 vezes.
- Centrifugar os hESCs a 200 x g por 2 min no RT.
- Aspire o supernasce e resuspenque suavemente as células em 1 mL de mTesR médio.
- Aspire o meio DMEM/F12 da placa e semee as células em um poço de placa de 6 poços a uma densidade de 1 x 105 células em 2 mL de mTesR.
- Incubar em uma incubadora de CO2 de 5% e manter as células substituindo por meio mTesR pré-aquecido diariamente. Passagem as células em cerca de 70-80% de confluência ou quando as colônias celulares começam a fazer contato.
2. Passagem e diferenciação de células-tronco
- Para células de passagem, aspire o médio e incuba as células com 1 mL por poço de solução enzimática (por exemplo, Accutase por 5 min a 37 °C. Em seguida, transfira as células por tubulação para um tubo centrífuga de 15 mL contendo 4 mL de DMEM/F12 pré-rebocados a 37 °C.
- Centrifugar as células a 200 x g em RT por 2 min.
- Aspire o médio e suavemente resuspenque a pelota de célula em 1 mL de mTesR médio.
- Prepare placas de 24 poços com revestimento com 250 μL de 1x hESC-qualificado meio Matrigel com antecedência. Seed hESCs como descrito acima em uma densidade de 1 - 1,5 x 105 células por poço em 500 μL de mTesR médio.
- Deixe as células incubarem por 24 h a 37 °C em uma incubadora de CO2.
3. Formação DE
- Prepare soluções de estoque de 100 μg/mL Activin A com DPBS contendo 0,2% BSA e 3 mM CHIR99021 com DMSO.
- Prepare o estágio I diferenciar o meio básico complementando o meio RPMI com 1x B27.
- Adicione Activin A a uma concentração final de 100 ng/mL e CHIR99021 a uma concentração final de 3 μM em um volume apropriado de meio básico de diferenciação pré-aquecido estágio I.
- Aspirar mTesR médio das células e substituir por mídia de diferenciação estágio I contendo fatores de diferenciação adicionais (por exemplo, 0,5 mL por poço de uma placa de 24 poços).
- Permita que as células incubam por 3 dias a 37 °C em uma incubadora de CO2, substituindo a mídia do Estágio I diariamente por fatores de diferenciação recém-adicionados (Dias 0-2).
NOTA: Após 3 dias de diferenciação, as células diferenciadas devem expressar marcadores de células DE, como FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4 e FOXA1 (mínimo de 80% do SOX17 necessário para prosseguir).
4. Diferenciação de células progenitoras hepáticas
- Prepare a diferenciação da fase II da mídia básica, dissolvendo a substituição do soro de nocaute (KOSR) para uma concentração final de 20% no DMEM knock out.
- Prepare o estágio II de diferenciação contendo 1% de DMSO, 1x GlutaMAX, 1x solução de aminoácido não essencial (NEAA), 100 μM 2-mercaptoethanol e 1x penicilina/estreptomicina (P/S) para o volume apropriado de KOSR/knockout DMEM.
- No dia 3 de diferenciação, aspire o médio e substitua pelo meio estágio II (por exemplo, 0,5 mL por poço de uma placa de 24 poços). Em seguida, incubar por 24 horas.
- No dia 4 de diferenciação, aspire o médio e substitua pelo meio estágio II (por exemplo, 1 mL por poço de uma placa de 24 poços).
- Troque o meio a cada dois dias (substitua o meio no dia 6).
NOTA: Após 8 dias de diferenciação, as células diferenciadas devem expressar marcadores apropriados de células progenitoras hepáticas, como HNF4α, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA (mínimo 80% de HNF4α necessário para prosseguir).
5. Diferenciação de hepatocitos
- Prepare 10 soluções de estoque hepatocyte de μg/mL (HGF), 20 μg/mL Oncostatin (OSM) com DBPS (contendo 0,2% BSA) e filtro com uma membrana de filtro de 0,22 μm.
- Preparar o meio básico de diferenciação estágio III (HepatoZYME-SFM) médio suplementado com hidrocortisona 10 μM-21-hemisuccinato e 1x P/S).
- Adicione hgf a uma concentração final de 10 ng/mL e OSM a uma concentração final de 20 ng/mL ao volume apropriado do meio de diferenciação pré-aquecido estágio III.
- No dia 8 de diferenciação, aspire estágio II médio das células e substitua pelo meio estágio III (por exemplo, 1 mL por poço de uma placa de 24 poços).
- Permita que as células incubam por 10 dias a 37 °C em uma incubadora de CO2, mudando a mídia do Estágio III a cada dois dias com fatores de diferenciação recém-adicionados (Dias 8-18).
NOTA: Após 18 dias de diferenciação, as células diferenciadas devem expressar marcadores característicos de hepatócitos, como AAT, ALB, TTR, HNF4α, NTCP, ASGR1, CYP3A4. A porcentagem de células albumina-positivas geralmente é superior a 90%.
6. Isolamento do RNA, síntese de CDNA e análise RT-qPCR
- Aspirar meio a partir de células e adicionar a quantidade adequada de reagente RNAiso Plus, (por exemplo, 0,3 mL por poço de uma placa de 24 poços). Colete o supernatante em um tubo de 1,5 mL e deixe ficar em RT por 5 minutos.
- Adicione 60 μL de reagente de clorofórmio e deixe-o em RT por 5 min. Em seguida, centrífuga a 12.000 x g por 15 min.
- Colete o supernatante de 125 μL e transfira-o para outro tubo de centrífuga. Adicione 160 μL de isopropanol, misture bem e fique em RT por 10 minutos.
- Centrifugar a 12.000 x g por 10 min.
- Retire o supernascido, adicione 75% de etanol ao precipitado e centrífuga a 7.500 x g por 5 min.
- Após a secagem no RT, adicione 40 μL de água tratada com DEPC para dissolver. Para qPCR, transcrever reverso 2 μg de RNA total com um kit de transcrição reversa de acordo com o protocolo do fabricante.
- Execute o RT-qPCR usando um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
- Normalize a expressão genética em relação às células-tronco não induzidas e determine a variação da dobra após a normalização para GAPDH.
7. Validação de Imunofluorescência de Diferenciação
- Prepare 1x tampão de lavagem PBST adicionando 0,1% Tween-20 ao PBS.
- Aspirar meio a partir de células aderentes e lavar brevemente com PBS em RT em um shaker.
- Aspire PBS e incuba células com 500 μL de metanol gelado por poço de uma placa de 24 poços para fixar as células a -20 °C durante a noite.
- Remova o metanol e lave as células 3 vezes com PBS em um shaker por 10 minutos cada vez no RT.
- Bloqueie células com 500 μL de 5% de BSA preparadas em PBS para 1-2 h em RT em um shaker.
- Diluir o anticorpo primário em 1: 200 na mesma solução usada para o bloqueio.
- Incubar as células fixas em uma solução de anticorpos primários de 300 μL durante a noite a 4 °C em um agitador.
- Após a incubação durante a noite, lave as células 3 vezes com PBST por 10 minutos cada vez no RT em um shaker.
- Prepare a solução de anticorpos secundários na solução de bloqueio às 1:1000.
- Incubar em 300 μL de solução de anticorpos secundários protegido da luz por 1 h em RT em um shaker.
- Aspirar solução de anticorpos secundários e lavar células 3 vezes com PBST por 10 minutos cada vez em RT em um shaker.
- Incubar células com 300 μL de 1 μg/mL DAPI por 3-5 min e, em seguida, lavar duas vezes com PBST.
- Após aspirar PBST, adicione uma quantidade apropriada de PBS para tirar fotos sob um microscópio de fluorescência.
8. Análise de manchas ocidentais
- Prepare 1x tampão de lavagem TBST adicionando 0,1% Tween-20 à solução salina tamponada por Tris (TBS).
- Prepare o buffer de eletroforese SDS-PAGE e o buffer de transferência ocidental usando um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
- Resolva a proteína celular total (40 μg) em um gel de poliacrilamida de sulfato de sulfato de sódio de 10% de sódio e execute no tampão de eletroforese SDS-PAGE a 15 mA corrente constante por cerca de 2 h.
- Transfira o gel para uma membrana de difluoreto de polivinilidene (PVDF) a 300 mA de corrente constante por 2 h a baixa temperatura.
NOTA: O tempo de funcionamento e o tempo de transferência podem variar dependendo do equipamento utilizado e do tipo e porcentagem do gel. - Bloqueie a membrana com 3% de BSA preparado em TBST para 1 h em RT em um shaker.
- Incubar em solução de anticorpos primários (diluição de 1:1000) durante a noite a 4 °C em um agitador.
- Após a incubação durante a noite, lave a membrana de manchas 3 vezes com TBST por 15 minutos por vez no RT em um shaker.
- Incubar em solução de anticorpos secundários (diluição de 1:2000) por 2 h em RT em um shaker.
- Descarte a solução de anticorpos secundários e lave a membrana 3 vezes com TBST, por 15 minutos cada vez, no RT em um shaker.
- Visualize bandas imunoreativas usando um reagente de chemiluminescência seguido de autoradiografia. Use β-actin como controle de carregamento.
9. Absorção verde da indocianina
- Prepare a solução de estoque verde indocyanina de 200 mg/mL em DMSO.
- Prepare uma solução de trabalho complementando o estágio III de diferenciação com solução verde indocyanina para uma concentração final de 1 mg/mL.
- Incubar em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 por 1-2 h.
- Aspirar médio e lavar as células 3 vezes com PBS.
- Fotografia sob um microscópio.
10. Coloração periódica ácido-Schiff (PAS) e coloração de Hemaoxílina-Eosina (H&E)
- Aspirar o meio das células aderentes e lavar brevemente duas vezes com PBS.
- Para fixação celular, aspire PBS e incubar células com metanol gelado a -20 °C durante a noite.
- Visualize o armazenamento de glicogênio por manchas PAS e observe células binucleadas por manchas H & E usando um kit seguindo as instruções do fabricante.
- Tire imagens com um microscópio de fluorescência.
11. Ensaio para atividade CYP
- Medir a atividade CYP450 usando ensaios baseados em células disponíveis comercialmente (Ensaios P450-Glo) de acordo com as instruções do fabricante.
- Use três repetições independentes para testes. Os dados são representados como a média ± SD.
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Representative Results
O diagrama esquemático da indução de HLC de hESCs e imagens representativas de campo brilhante de cada estágio de diferenciação são mostrados na Figura 1. No Estágio I, Activin A e CHIR99021 foram adicionados por 3 dias para induzir células-tronco a formar células de endoderme. No Estágio II, as células de endoderme se diferenciaram em células progenitoras hepáticas após serem tratadas com meio de diferenciação por 5 dias. Na Fase III, os hepatócitos precoces amadureceram e se diferenciaram em HLCs após 10 dias em HGF e OSM (Figura 1A). Na fase final de diferenciação, as células apresentaram um fenótipo típico de hepatocito (As células são polígonas e distribuídas uniformemente e regularmente) (Figura 1B).
Para confirmar ainda mais a diferenciação hepática, RT-qPCR, manchas de imunofluorescência e manchas ocidentais foram utilizadas para detectar marcadores de células de endoderme, células progenitoras hepáticas e hepatócitos maduros(Figura 2). As células diferenciadas apresentaram altos níveis de expressão de genes e proteínas relacionados à diferenciação em cada estágio, como os marcadores de endoderme SOX17 (89,7± 0,8%) no dia 3, marcador progenitor hepático HNF4α (81,3±2,9%) no dia 8, AFP (86,6±0,3%) no dia 14, e marcador hepatocitado maduro ALB (94,5±1,1%) no dia 18. Esses resultados indicam que as células semelhantes à hepatocita são geradas por este protocolo.
Para detectar se os HLCs possuem funções de hepatocitado, detectamos absorção de ICG, armazenamento de glicogênio e atividade CYP de HLCs, bem como a coloração de H&E realizada. Como pode ser visto, foram observadas as HLCs com coloração verde(Figura 3A)e extensa mancha de ácido citoplasmático-Schiff (rosa a roxo)(Figura 3B),que é consistente com o armazenamento de glicogênio. Além disso, podemos ver a morfologia representativa de uma hepatocita binucleada típica(Figura 3C). Por fim, a atividade enzimática do CYP3A4, o CIP metabólico mais importante do fígado, foi confirmada pelo ensaio de atividade enzimática(Figura 3D).
| Nome de Reagente | Companhia | Número do catálogo | Concentração de Estoque | Concentração Final |
| 2-Mercaptoetanol | Sigma | M7522 | 50 mM | 100 μM |
| 488 cabra rotulada contra mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | - | SE: 1:1000 |
| 488 cabra rotulada contra Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | - | SE: 1:1000 |
| Accutase | Tecnologias de células-tronco | 7920 | 1 x | 1 x |
| Activin A | peproTech | 120-14E | 100 μg/ml | 100 ng/ml |
| Anti - Albumina (ALB) | Sigma Aldrich | A6684 | - | SE: 1:200; WB:1:1000 |
| Anti - Outubro Humano4 | Abcam | Ab19587 | - | SE: 1:200 |
| Anti - α-Fetoproteína (AFP) | Sigma Aldrich | A8452 | - | SE: 1:200; WB:1:1000 |
| Anti-SOX17 | Abcam | ab224637 | - | SE: 1:200 |
| Fator Nuclear Anti-Hepatócito 4 alfa (HNF4α) | Sigma Aldrich | SAB1412164 | - | SE: 1:200 |
| Suplemento B-27 | Gibco | 17504-044 | 50 x | 1 x |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | - | 5.00% |
| CHIR99021 | Sigma Aldrich | SML1046 | 3 mM | 3 μM |
| DAPI | Beyotime | C1006 | - | - |
| DEPC-água | Beyotime | R0021 | - | - |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | 500 μM | 250 nM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | 1 x | 1 x |
| DMSO | Sigma Aldrich | D5879 | 1 x | 1 x |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | 1 x | 1 x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 x | 1 x |
| Kit de coloração H&E | Beyotime | C0105S | - | - |
| Fator de crescimento do hepatocito (HGF) | peproTech | 100-39 | 10 μg/ml | 10 ng/ml |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | - | - |
| Hidrocortisona-21-hemisuccinato | Sigma Aldrich | H4881 | 1 mM | 10 μM |
| Indocianina | Sangon Biotech | A606326 | 200 mg/mL | 1 mg/mL |
| Nocautear DMEM | Gibco | 10829-018 | 1 x | 1 x |
| Derrubar várias espécies do SR | Gibco | A31815-02 | - | 20% |
| Matrigel hESC-qualificado | Corning | 354277 | 60 x | 1 x |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | 100 x | 1 x |
| Suplemento mTesR 5X | Tecnologias de células-tronco | 85852 | 5 x | 1 x |
| mTesR Basal Medium | Tecnologias de células-tronco | 85851 | 1 x | 1 x |
| Oncostatina (OSM) | peproTech | 300-10 | 20 μg/ml | 20 ng/ml |
| P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE) | Promega | V8901 | - | - |
| Kit de coloração PAS | Solarbio | G1281 | - | - |
| Caneta/Estreptococos | Gibco | 15140-122 | 100 x | 1 x |
| IgG anti-rato-de-rato-de-peroxidase-conjugado | ZSGB-BIO | ZB-2305 | - | WB: 1:2000 |
| Tampão de diluição de anticorpos primários para mancha ocidental | Beyotime | P0256 | - | - |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | - | - |
| RNAiso Plus | Takara | 9109 | - | - |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | 1 x | 1 x |
| Leite desnatado | Sangon Biotech | A600669 | - | 5.00% |
| SYBR Green Master Mix | Termo Pescador Científico | A25742 | - | - |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | 15 μM | 15 nM |
| Tween | Sigma Aldrich | WXBB7485V | - | 0.10% |
Tabela 1: Componentes da cultura celular e da mídia base de diferenciação.
| Nome de Gene | Abreviaturas | sequências de primers(F) | sequências de primers (R) |
| POU Classe 5 Homeobox 1 | OCT4 | AGCGAACCAG TATCGAGAAC |
TTACAGAACC ACACTCGGAC |
| Caixa de garfo A2 | FOXA2 | GCATTCCCAATC TTGACACGGTGA |
GCCCTTGCAGC CAGAATACACATT |
| Fator de transcrição da caixa SRY 17 | SOX17 | TATTTTGTCTGC CACTTGAACAGT |
TTGGGACACAT TCAAAGCTAGTTA |
| Receptor de classe frizzled 8 | FZD8 | ATCGGCTACAA CTACACCTACA |
GTACATGCTGC ACAGGAAGAA |
| C-X-C Motif Quimiokine Receptor 4 | CXCR4 | CACCGCATCT GGAGAACCA |
GCCCATTTCCT CGGTGTAGTT |
| Caixa de garfo A1 | FOXA1 | AAGGCATACGA ACAGGCACTG |
TACACACCTTG GTAGTACGCC |
| Msh Homeobox 1 | MSX1 | CGCCAAGGCA AAGAGACTAC |
GCCATCTTCAG CTTCTCCAG |
| Mesogenina 1 | MSGN1 | GCTGGAATCCTA TTCTTCTTCTCC |
TGGAAAAGCTAACA TATTGTAGTCCAC |
| Homeobox tipo caudal 1 | CDX1 | AAGGAGTTTCAT TACAGCCGTTAC |
TGCTGTTTCTTCT TGTTCACTTTG |
| Homeobox 1 | EVX1 | GCTGTCTCTCTG AACAAAATGCT |
CATCTCTCACTCT CTCCTCCAAA |
| Mesoderm Fator de Transcrição BHLH Posterior 2 | MESP2 | AGCTTGGGTG CCTCCTTATT |
TGCTTCCCTGAA AGACATCA |
| NK2 Homeobox 5 | NKX2.5 | CAAGTGTGCG TCTGCCTTT |
CAGCTCTTTCTT TTCGGCTCTA |
| ISL LIM Homeobox 1 | ISL1 | AGATTATATCAGGT TGTACGGGATCA |
ACACAGCGGA AACACTCGAT |
| Hepatocitos Fator Nuclear 4 Alfa | HNF4α | ACATGGACATG GCCGACTAC |
CGTTGAGGTTG GTGCCTTCT |
| Fetoproteína Alfa | AFP | ACTGAATCCAG AACACTGCA |
TGCAGTCAATG CATCTTTCA |
| Fator de transcrição da caixa T 3 | TBX3 | TTATGTCCCAG CGAGGGTGA |
ACGTGGTGGTG GAGATCTTG |
| Transthyretina | TTR | AGAAAGGCTG CTGATGAC |
GTGCCTTCCA GTAAGATTTG |
| Albumina | ALVA | CCCCAAGTGT CAACTCCA |
GTTCAGGACCA CGGATAG |
| Polipeptídeo de cotransportamento de taurocholate de sódio | NTCP | CATAGGGATCGT CCTCAAATCCA |
GCCACACTGCAC AAGAGAATG |
| CCAAT Enhancer Binding Protein Alpha | CEBPA | AGGAGGATGAA GCCAAGCAGCT |
AGTGCGCGATC TGGAACTGCAG |
| Família Serpin Um Membro 1 | AAT | AAATGAACTCA CCCACGAT |
ACCTTAGTGATG CCCAGT |
| Receptor de ásia-micoproteína 1 | ASGR1 | CAGACCCTGAGA CCCTGAGCAA |
TCCTGCAGCTGG GAGTCTTTTCT |
| Cytochrome P450 Família 3 Subfamília Membro 4 | CYP3A4 | TTGTAATCACTG TTGGCGTGGG |
AATGGGCAAAGT CACAGTGGA |
Tabela 2: Sequências de primer para análise q-PCR.
Figura 1: Diagrama esquemático do protocolo para especificação de DE e HLCs. (A) Apresentação esquemática da estratégia de diferenciação de 3 estágios utilizada neste estudo. (B) Morfologia das células diferenciadas nos dias 0, 3, 8, 14 e 18. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Expressão de marcador específica do estágio durante a diferenciação do HESC em HLCs. (A) expressão mRNA de genes específicos do estágio. (B-C) Expressão proteica de genes específicos do estágio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Funções de HLCs derivados do hESC. (A) HLCs tratados por 1h com 1 mg/mL verde indocyanina demonstram absorção conforme avaliado pela microscopia de fase. (B) Imagens de coloração do PAS representativas indicando armazenamento de glicogênio. (C) Representante he imagens de coloração mostrando células binucleadas. (D) Atividade de nível basal das enzimas principais citocromáticas P450. Todos os valores são apresentados como média ± barra de escala SD. = 100 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, apresentamos um método stepwise que induz os HLCs dos hESCs em três estágios. Na primeira etapa, Activin A e CHIR99021 foram utilizados para diferenciar os hESCs em DE. No segundo estágio, ko-DMEM e DMSO foram usados para diferenciar DE em células progenitoras hepáticas. No terceiro estágio, HZM mais HGF, OSM e hidrólio 21-hemisuccinato de sódio foram usados para continuar a diferenciar células progenitoras hepáticas em HLCs.
As seguintes etapas críticas devem ser levadas em consideração durante o uso do protocolo. A densidade inicial de diferenciação das células e o tempo preciso de mudanças médias são fatores importantes para a diferenciação bem sucedida. Quando começamos a nos diferenciar, devemos garantir que a densidade inicial de semeadura seja apropriada, em uma confluência de cerca de 30-40%, quando as células estão apenas começando a entrar em contato entre si, e que os espaços intercelulares são uniformemente organizados em uma rede sob o campo da visão. Durante a diferenciação, o meio de diferenciação correspondente deve ser alterado precisamente no momento indicado, especialmente na primeira etapa e no momento chave de cada etapa de substituição, para garantir que as células se diferenciem no modo e estágio imitando o processo de desenvolvimento embrionário.
A primeira etapa de diferenciação dos hESCs em DE é particularmente importante. Geralmente há um grande número de células que se desprendem e flutuam durante o Estágio I de diferenciação, que é um estágio crítico para o destino celular, mas neste momento as células ainda mantêm a capacidade de proliferar. Portanto, a confluência de células pode chegar a cerca de 90-100% no final da Fase I. Além disso, deve-se notar que no início da Fase III de diferenciação (ou seja, dia 8), o citoplasma das células começa a se condensar, resultando na gradual aquisição de uma morfologia esbelta. No entanto, no dia 10, o citoplasma se recupera gradualmente, e no dia 14, as células começam a mostrar a óbvia morfologia poliédral dos hepatócitos.
Neste estudo, as HLCs obtidas estão mais próximas dos hepatócitos fetais, pois a AFP é mais expressa do que a ALB no dia 18. Embora os HLCs gerados exerçam características e funções de hepatócitos, ainda há uma lacuna entre os HEHCs e os hepatócitos humanos primários, indicando que nossas células diferenciadas ainda não estão funcionalmente maduras. Portanto, o trabalho futuro precisará focar na otimização do método de diferenciação.
Atualmente, fatores de crescimento e pequenos compostos moleculares como Activin A9,10,14, Wnt3a15, CHIR16, Torin217 e IDE118,19 são comumente usados para induzir a diferenciação DE em vários sistemas de diferenciação. O grupo Song usou Activin A para diferenciar células-tronco em DE, e usou FGF4 (Fibroblast Growth Factor 4), BMP2 (Proteína morfogenética óssea 2), HGF, KGF (fator de crescimento de queratinócito), OSM e Dex para especificação hepática e maturação de HLCs20. O grupo Sullivan induziu DE por Activin A e Wnt 3a, e induziu HLCs por β-ME (2-mercaptoetanol), DMSO, Insulina, HGF, OSM21. A equipe siller utilizou CHIR99021 para diferenciação DE, DMSO, Dihexa (fator de crescimento hepatocito agonista N-hexanoic-Tyr), e Dex para diferenciação HLC para obter HLC com características de função hepática16. No entanto, alguns desses métodos usam muitos fatores de crescimento recombinantes para gerar DE com alto custo e alguns deles usam apenas pequenas moléculas para gerar DE com menor eficiência. A Activin A é um fator crítico para a geração DE. Tentamos substituir a Activin A por outras moléculas pequenas, mas geralmente temos uma menor eficiência. Por isso, adotamos o método de adicionar Activin A e CHIR99021 como fatores indutores de DE, e detectamos genes relacionados à diferenciação em cada estágio por q-PCR, imunofluorescência e mancha ocidental.
Nos últimos anos, a criação de um sistema experimental para indução direcionada de HLC a partir de esCs é uma base importante para a modelagem do desenvolvimento de hepatócitos e medicamentos de rastreamento para doenças relacionadas ao fígado. Ao mesmo tempo, também pode fornecer uma fonte eficaz de células para transplante de hepatocita, engenharia de tecido hepático, fígados bioartificiais e outras pesquisas. Foi relatado que os HLCs derivados de células-tronco têm sido usados para realizar vários estudos sobre infecção viral como modelo de triagem de medicamentos para prever respostas hepatotóxicas induzidas por medicamentos e estudar a via imune inata e sinalizar vias das células10,22,23,24,25. Geralmente, este método introduz em detalhes uma técnica eficiente de diferenciação celular semelhante ao hepatocito de hESCs que pode diferenciar com sucesso os hESCs em hepatócitos funcionais maduros. Os resultados fornecem uma plataforma para o desenvolvimento de aplicativos baseados em HLC.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (No. 81870432 e 81570567 a X.L.Z.), (No. 81571994 para P.N.S.); a Fundação de Ciência Natural da Província de Guangdong, China (N. 2020A1515010054 para P.N.S.), Fundação Universidade Li Ka Shing Shantou (N. No. L1111 2008 para P.N.S.). Gostaríamos de agradecer ao Prof. Stanley Lin da Faculdade de Medicina da Universidade de Shantou por conselhos úteis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
| 488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
| 488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
| Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
| Anti - Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti - Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
| Anti - α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
| H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
| Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
| Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
| mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
| P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
| PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
| Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
| Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
| Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |
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