Bruke tidsbestemt proteinindusert fluorescensforbedring for å identifisere stabile lokale konformasjoner En α-Synuclein Monomer om gangen

Summary

Tidsavklart proteinindusert fluorescensforbedring med ett molekyl er en nyttig fluorescensspektroskopisk nærhetssensor som er følsom for lokale strukturelle endringer i proteiner. Her viser vi at den kan brukes til å avdekke stabile lokale konformasjoner i α-Synuclein, som ellers kalles globulært ustrukturert og ustabilt når den måles ved hjelp av FRET-linjalen med lengre rekkevidde.

Abstract

Ved hjelp av spektroskopiske herskere for å spore flere konformasjoner av enkeltbiomolekyler og deres dynamikk har revolusjonert forståelsen av strukturell dynamikk og dens bidrag til biologi. Mens den FRET-baserte linjalen rapporterer om interfargeavstander i 3-10 nm-serien, rapporterer andre spektroskopiske teknikker, for eksempel proteinindusert fluorescensforbedring (PIFE), om nærheten mellom et fargestoff og en proteinoverflate i det kortere 0-3 nm-området. Uavhengig av valgmetoden, henter bruken i å måle fritt diffuserende biomolekyler en om gangen histogrammer av den eksperimentelle parameteren som gir separate sentralt fordelte underpopulasjoner av biomolekyler, hvor hver underpopulasjon representerer enten en enkelt konformasjon som forble uendret innen millisekunder, eller flere konformasjoner som interkonverterer mye raskere enn millisekunder, og dermed en gjennomsnittlig sub-ut underpopulasjon. I enkeltmolekylet FRET, hvor den rapporterte parameteren i histogrammer er den mellomfargede FRET-effektiviteten, ble et iboende uordnet protein, som α-Synuclein monomer i buffer, tidligere rapportert å vise en enkelt gjennomsnittlig underpopulasjon av flere konformasjoner som interkonverterer raskt. Mens disse tidligere funnene avhenger av 3-10 nm-serien til den FRET-baserte linjalen, forsøkte vi å sette dette proteinet på prøve ved hjelp av enkeltmolekyl pife, hvor vi sporer fluorescenslevetiden til stedsspesifikke sCy3-merkede α-Synuclein-proteiner en om gangen. Interessant nok, ved hjelp av denne kortere rekkeviddespektroskopiske nærhetssensoren, viser sCy3-merkede α-Synuclein flere livsunderpopulasjoner med tydelig forskjellige gjennomsnittlige levetider som interkonverterer i 10-100 ms. Disse resultatene viser at selv om α-Synuclein kan være uorden globalt, oppnår det likevel stabile lokale strukturer. Oppsummert fremhever vi i dette arbeidet fordelen ved å bruke forskjellige spektroskopiske nærhetssensorer som sporer lokale eller globale strukturelle endringer en biomolekyl om gangen.

Introduction

I løpet av de siste to tiårene har fluorescensbaserte metoder med ett molekyl blitt et kraftig verktøy for måling av biomolekyler^1,2, som undersøker hvordan forskjellige biomolekylære parametere distribueres, samt hvordan de dynamisk interkonverterer mellom forskjellige underpopulasjoner av disse parametrene ved sub-millisekunders oppløsning^3,4,5. Parametrene i disse teknikkene inkluderer energioverføringseffektiviteten i FRET-målinger ^6,7, fluorescensanisotropi^8,9, fluorescens kvanteutbytter og levetider^10,11, som en funksjon av forskjellige fluorescens slukke¹² eller forbedring^{13 mekanismer.} En av disse mekanismene, bedre kjent som proteinindusert fluorescensforbedring (PIFE)¹⁴ introduserer forbedringen av fluorescens kvanteutbytte og levetid som en funksjon av sterisk obstruksjon til fri isomerisering av fluoroforen når den er i spent tilstand, forårsaket av proteinoverflater i nærheten av^{fargestoffet 14,15,16,17,18,19} . Både FRET og PIFE regnes som spektroskopiske linjaler eller nærhetssensorer siden deres målte parameter er direkte knyttet til et romlig mål innenfor den merkede biomolekylen under måling. Mens FRET-effektiviteten er relatert til avstanden mellom et par fargestoffer innenfor et område på 3-10 nm²⁰, øker PIFE-sporene i fluorescens kvanteutbytter eller levetider relatert til avstanden mellom fargestoffet og en overflate av et nærliggende protein i området 0-3 nm¹⁹.

Enkeltmolekyl fret har blitt mye brukt for å gi strukturell innsikt i mange forskjellige proteinsystemer, inkludert iboende uordnede proteiner (IDPs)²¹, for eksempel α-Synuclein (α-Syn)²². α-Syn kan danne bestilte strukturer etter binding til forskjellige biomolekyler og under forskjellige forhold^{23,24,25,26,27,28,29,30}. Men når den er ubundet, er α-Syn monomer preget av høy konformasjons heterogenitet med raskt mellomkonverterende konformasjoner^31,32.

Konformasjonene til α-Syn har blitt studert tidligere ved hjelp av ulike teknikker som hjelper til med å identifisere konformasjonsdynamikk i slike svært heterogene og dynamiske proteinsystemer^{33,34,35,36,37,38,39}. Interessant, enkeltmolekyl FRET (smFRET) målinger av α-Syn i buffer rapporterte en enkelt FRET-populasjon^39,40 som er et resultat av tidsgjennomsnitt av konformasjoner dynamisk interkonverterer til tider mye raskere enn den typiske diffusjonstiden til α-Syn gjennom det konfokale stedet (ganger så raskt som få mikrosekunder og enda raskere enn det, i forhold til typiske millisekunder diffusjonstider) ,^{40 41}. Ved hjelp av en FRET spektroskopisk linjal med 3-10 nm avstandsfølsomhet rapporterer imidlertid noen ganger bare om generelle strukturelle endringer i et lite protein som α-Syn. Enkeltmolekylmålinger ved hjelp av spektroskopiske nærhetssensorer med kortere avstandsfølsomhet har potensial til å rapportere om dynamikken i lokale strukturer. Her utfører vi pife-målinger av α-Syn og identifiserer ulike underpopulasjoner av fluorescenslevetider som kartlegger ulike lokale strukturer med overganger mellom dem så sakte som 100 ms. Dette arbeidet oppsummerer tidsavklarte smPIFE-målinger av fritt diffuserende α-Syn-molekyler en om gangen, i buffer og når de er bundet til SDS-baserte membraner som en kortdistanse enkeltmolekylspektroskopisk nærhetssensor.

Protocol

1. Plasmid transformasjon Tilberedning av 0,5 L SOC-medium Vei 10 g trypton, 2,5 g gjærekstrakt, 0,25 g natriumklorid (NaCl), 0,1 g kaliumklorid (KCl). Tilsett dobbelt destillert vann (DDW) til totalt volum på 0,5 L. Juster til pH 7 ved å tilsette natriumhydroksid (NaOH). Forbered lager aliquots på 100 ml og autoklav. Før bruk tilsettes 0,5 ml steril magnesiumklorid (MgCl2) og 1,8 ml steril glukose til 100 ml SOC. Tine BL…

Representative Results

Som en IDP, når den ikke er bundet til en annen biomolekyl, viser α-Syn strukturell dynamikk mellom flere konformasjoner, med overganger ved få mikroseconds40 og til og med på hundrevis av nanoseconds41. Når α-Syn krysser det konfiske stedet, kan det gjennomgå tusenvis av overganger mellom konformasjoner. Faktisk var dette tilfelle da smFRET ble brukt39,40. Her utfører vi smPIFE-målinger for å undersøke d…

Discussion

Omfattende biokjemiske og biofysiske studier ble utført for å studere de strukturelle egenskapene til α-Syn og dens uordnede natur^{33,34,35,36,37,38}. Flere arbeider har allerede brukt fritt diffuserende smFRET for å undersøke den intramolekylære dynamikken i α-Syn monomer fri for binding. Disse verkene rapporterte den h…

Materials

Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units	Merc	C7715	cutoff: 100 kDa
ammonium sulfate	Sigma-Aldrich	A4418
BSA	Sigma-Aldrich	A9647
cysteamine	Sigma-Aldrich	30070
dialysis bags – MEGA GeBaFlex-tube	Gene Bio-Application	MEGA320
dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Fast SeeBand staining solution	Gene Bio-Application	SB050
Glycine	Sigma-Aldrich	50046
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES	Sigma-Aldrich	54457
HiTrap Desalting 5 mL	Sigma-Aldrich	GE17-1408
6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (TROLOX)	Sigma-Aldrich	238813
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
LB broth	Sigma-Aldrich	L3152
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	63068
MonoQ column	Sigma-Aldrich	54807
protein LoBind tube	Sigma-Aldrich	EP0030108094	0.5 mL
Rinse a µ-slide 18	Ibidi	81816
SDS	Sigma-Aldrich	75746
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	71507
Sterile Cell spreaders, Drigalski spatulas	mini-plast	815-004-05-001
streptomycin sulfate	Sigma-Aldrich	S9137
sulfo-Cy3 maleimide	abcam	ab146493
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	Sigma-Aldrich	75259
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	93363
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293
Yeast Extract	Sigma-Aldrich	Y1625