2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.
Summary
당사는 2D 및 3D 인간 유도 다능성 줄기세포(hIPSC)의 생성 및 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 1차 실슘(PC) 생체 발생 및 기능의 질적 및 정량적 분석을 가능하게 하는 보완적 방법론을 제시합니다.
Abstract
1차 섬모(PC)는 대부분의 포유류 세포의 표면에서 튀어나온 비운동적 동적 마이크로투룰계 세포기관이다. 그(것)들은 세포 주기의 G1/G0 단계 도중 오래된 중심에서 나타나고, 세포가 G2/M 상 경계에서 세포 주기를 다시 입력할 때 분해하는 동안. 그들은 많은 세포 프로세스에 중요한 세포 외 신호를 감지하고 변환하여 신호 허브로 작동합니다. 대부분의 세포 유형과 유사하게, 모든 신코르티칼 신경줄기 및 전구 세포(NSPC)는 정상 뇌피질 발달에 필요한 특정 신호를 감지하고 변환할 수 있도록 PC를 수용하는 것으로 나타났습니다. 여기서, 신피성 발달 시 PC의 참여를 더욱 해부하기 위해 인간 유도 만능 줄기 세포(hIPSC)로부터 2차원(2D) 및 3차원(3D) 세포 기반 모델을 생성하고 특성화하는 상세한 프로토콜을 제공합니다. 특히 소닉 고슴도치(SHH) 경로의 트랜스듀션을 포함한 2D 신경 로제트 유래 NSPC에서 PC 생체 발생 및 기능을 연구하는 프로토콜을 제시합니다. 대뇌 오르가노이드의 3차원(3D) 조직을 활용하기 위해 토토 면역스테인드 대뇌 오르가노이드의 3D 이미징을 위한 간단한 방법을 설명합니다. 광학 클리어링 후, 전체 오르가노이드를 빠르게 획득하면 전체 오르가노이드의 신코르테컬 전구및 뉴런에서 센트로좀과 PC를 모두 검출할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 3D 공간 정보의 상당한 정도를 보존하고 PC 생체 발생 및 기능의 상세한 질적 및 정량적 분석에 필요한 고해상도 획득을 허용하는 두꺼운 자유 부동 오르가노이드 섹션의 면역 염색 및 청산 절차를 자세히 설명합니다.
Introduction
1차 섬모(PC)는 세포외 환경에서 과다한 화학 및 기계적 단서를 감지하고 트랜스포우하는 마이크로투벨계 세포기관입니다. 특히, PC는 척추동물에서 고슴도치 신호 경로의 침투를 위한 중앙 세포기관이다1,2. 대부분의 신경 세포는 오랫동안 PC를 품고 있는 것으로 나타났지만, 중추 신경계를 형성하는 이 세포기관의 기여는 오랫동안 저평가되어 왔습니다. 신구체 발달에 대한 연구는 여러 신경 줄기와 전구 세포 (NSPC)의 발견으로 이어졌으며, 모두 PC를 수용하고 있으며, 그 위치는 선조 운명 결정에 매우 중요하다고 제안되었습니다3,4,5,6,7. PC는 NSPC 확장 및 약정 8,9,10,11,12뿐만 아니라 신경 마이그레이션을 지원하는 방사형 신경교질 비계의 apicobasal 극성을 포함하여 정상적인 뇌 피질 개발에 필요한 세포 메커니즘에 중요한 것으로 나타났습니다13. 또한, PC는 피질 판14,15로의 접선 간 이동 중에 요구된다. 마지막으로, 대뇌 피질16,17에 있는 뉴런의 시냅스 연결의 확립에서 PC에 대한 역할이 제안되었습니다. 전부, 이 사실 인정은 대뇌 피질 발달의 중요한 단계에서 PC의 중요한 역할을 주장하고 뇌성 피질 발달의 근본적인 병리학 기계장치에 그들의 관여를 조사할 필요를 제기합니다.
최근 연구는 인간 모델과 동물 모델의 피질 발달 사이의 중요한 세포 및 분자 차이에 대한 이해를 크게 향상시켜 인간 모델 시스템을 개발할 필요성을 강조했습니다. 이 보기에서, 인간 유도된 다능성 줄기 세포 (hIPSCs)는 관련 유전 및 세포 맥락에서 질병 병발생을 연구하는 유망한 접근을 나타냅니다. 부착 된 2 차원 (2D) 세포 기반 모델 또는 신경 로제트는 개발 대뇌 피질에서 볼 수있는 것과 유사한 NSPC를 포함, 이는 올바른 apicobasal 극성을 보여주는 로제트 모양의 구조로 조직된다20,21,22. 더욱이, 3차원(3D) 배양 시스템은 인간 뇌피질 발달의 많은 특징을 재구성하는 등쪽 전뇌 오르가노이드의 생성을 가능하게 한다23,24,25,26. 이 두 가지 보완적인 세포 기반 모델링 접근법은 대뇌 피질의 정상 및 병리학 적 발달 중에 PC의 참여를 해부하는 흥미로운 관점을 제공합니다.
여기에서는 신경 로제트및 파생 된 NSPC뿐만 아니라 등쪽 전뇌 오르가노이드의 생성 및 특성화를위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 또한 소닉 고슴도치 통로의 전도를 테스트하고 이 경로에 관련된 중요한 분자의 역학을 분석하여 NSPC에 존재하는 PC의 생체 발생 및 기능을 분석하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 대뇌 오르가노이드의 3D 조직을 활용하기 위해, 우리는 또한 전체 오르가노이드의 가벼운 시트 현미경 덕분에, 전체 오르가노이드의 가벼운 시트 현미경 덕분에, 빠른 취득을 허용하는 토토 면역 스테인드 대뇌 오르가노이드의 3D 이미징을위한 간단하고 비용 효율적인 방법을 설정, 고해상도와 전장기의 뉴런의 모든 유형에 PC를 시각화 할 수 있습니다. 마지막으로, 150μm 자유부동 구간에 면역조직화학을 적용하여 공진스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 후속 개간 및 획득을 통해 PC 생체 발생 및 기능의 상세한 분석에 필요한 고해상도 이미지 수집을 가능하게 했습니다. 구체적으로, 3D 이미징 소프트웨어는 PC의 길이, 수 및 방향을 포함한 형태학적 매개변수의 후속 분석과 함께 PC의 3D 재구성뿐만 아니라 축사메를 따라 섬모 구성 요소의 신호 강도 측정을 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
PC는 이제 NSPC 확장 및 약정을 포함하여 정상 뇌 피질 발달 18,19,31 동안 중요한 단계를 조절하는 주요 세포 기관으로 간주됩니다18,9,10,11,12뿐만 아니라 뉴런 마이그레이션13,14 및…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 S.T.(ANR-17-CE16-0003-01) 및 N.B.B.(ANR-16-CE16-0011 및 ANR-19-CE16-0002-01)에 대한 국가 국립 기관 드 라 레체쉬(ANR)의 보조금에 의해 지원되었습니다. LB는 투자 d’avenir 프로그램 (ANR-10-IAHU-01)과 베텐코트 슈엘러 (MD-PhD 프로그램)에서 ANR에 의해 지원됩니다. 이매진 연구소는 투자 d’avenir 프로그램 (ANR-10-IAHU-01, CrossLab 프로젝트)에 따라 ANR의 국가 자금 지원및 두 번째 인베스트먼트 d’Avenir 프로그램 (ANR-17-RHUS-0002)의 일환으로 지원됩니다.
Materials
| 2-Mercaptoéthanol (50 mM) | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| CellAdhere Dilution Buffer | StemCell Technologies | 7183 | |
| DMEM/F-12, Glutamax | ThermoFisher Scientific | 31331028 | |
| DMSO | ATCC | 4-X | |
| Dorsomorphin | StemCell Technologies | 72102 | |
| Easy Grip 35 10mm | Falcon | 353001 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | |
| EGF , 25µg | Thermofischer | PHG0315 | |
| FGF2 , 25µg | Thermofischer | PHG0264 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | StemCell Technologies | 7174 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | 12585014 | |
| KnockOut Serum | ThermoFisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin (1mg) | Thermofischer | 23017015 | |
| LDN193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381-250G | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| Neural Basal Medium | Thermofischer | 21103049 | |
| Orbital shaker | Dutscher | 995002 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PFA 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Poly-L-Ornithine (PO) | Sigma | P4957 | |
| Recombinant human BDNF 10 µg | Stem Cell Technologies | 78005 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| rSHH | R&D Systems | 8908-SH | |
| SAG | Santa Cruz | Sc-202814 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Stembeads FGF2 | StemCulture | SB500 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-250G | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Supplément N2- (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| TDE 2,2’-Thiodiethanol | Sigma Aldrich | 166782-500G | |
| Vitronectin | StemCell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 | StemCell Technologies | 72304 | |
| Primary Antibodies | |||
| ARL13B | Abcam | Ab136648 | 1/200e |
| ARL13B | Proteintech | 17711-1-AP | 1/500e |
| CTIP2 | Abcam | Ab18465 | 1/500e |
| GLI2 | R&D Systems | AF3526 | 1/100 |
| GPR161 | Proteintech | 13398-1-AP | 1/100 |
| N-Cadherin | BD Transduction Lab | 610921 | 1/500e |
| P-Vimentin | MBL | D076-3 | 1/500e |
| PAX6 | Biolegend | PRB-278P | 1/200e |
| PCNT | Abcam | Ab4448 | 1/1000e |
| S0X2 | R&D Systems | MAB2018 | 1/200e |
| SATB2 | Abcam | Ab51502 | 1/200e |
| TBR2 | Abcam | Ab216870 | 1/400e |
| TPX2 | NovusBio | NB500-179 | 1/500e |
| γTUBULIN | Sigma Aldrich | T6557 | 1/500e |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher Scientific | A21206 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF555 | ThermoFisher Scientific | A21422 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF647 | ThermoFisher Scientific | A21236 | 1/500e |
| Goat anti-rat AF555 | ThermoFisher Scientific | A21434 | 1/500e |
References
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