Dette er en metode til at isolere livmoder lymfoide celler fra både gravide og ikke-gravide mus. Denne metode kan bruges til flere downstream applikationer såsom FACS phenotyping, celle sortering, funktionelle assays, RNA-seq, og proteomics. Protokollen her viser, hvordan man fænotype gruppe 1 livmoder medfødte lymfoidceller ved flow cytometri.
Beskrevet her er en simpel metode til at isolere og fænotype mus gruppe 1 livmoder medfødt lymfoide celler (g1 uILCs) fra individuelle gravide livmoder ved flow cytometri. Protokollen beskriver, hvordan man kan oprette tid parring for at opnå flere synkrone dæmninger, den mekaniske og enzymatiske fordøjelse af den gravide livmoder, farvning af encellede suspensioner, og en FACS strategi til fænotype og diskriminere g1 uILCs. Selv om denne metode uundgåeligt mister den rumlige information om cellulær fordeling i vævet, protokollen er blevet anvendt med succes til at bestemme uILC heterogenitet, deres reaktion på moderens og fosterfaktorer, der påvirker graviditet, deres genekspression profil, og deres funktioner.
Beskrevet her er en simpel metode til at opnå et højt udbytte af livmoder medfødte lymfocytter fra individuelle gravide livmoder. Denne metode bevarer protein overflade udtryk og funktionalitet af livmoder medfødte lymfocytter, og det er velegnet til efterfølgende anvendelser såsom FACS phenotyping, RNAseq, proteomics eller funktionelle assays. Her er der fokus på fænotyping af gruppe 1 uILCs af flow cytometri.
Livmoderen består af tre lag: endometrium, myometrium og perimetrium (figur 1). Endometriet er slimhinden, foring lumen af livmoderen. Progesteron, produceret af corpus luteum, omdanner endometrium til decidua. Myometriet består af to lag af glat muskel, der udgør livmodervæggen. Perimetrium er serosa, der ombrydes livmoderen og forbinder det til bughinden gennem det brede ledbånd kaldet mesometrium. I et tværsnit af livmoderen kaldes den del, der er modsat lumen, mesometriesiden, mens den del tæt på lumen kaldes anti-mesometriesiden. En række moderle leukocytter befolker endometriet og decidua, herunder flere typer celler, hvor de medfødte immunceller repræsenterer langt de fleste celler. Medfødte lymfoidceller (ILCs), makrofager, dendritiske celler (DC), samt CD4 + og CD8 + T lymfocytter, regulatoriske T-celler (Tregs), og sjældne B-celler, kan alle spille vigtige roller i reguleringen af livmodermiljøet i hele graviditeten1,2. ILCs i livmoderen findes ikke kun i slimhinden, men også i myometrium i mus. Herunder alle tre grupper af ICS, livmoderen er faktisk det organ tættest befolket af gruppe 1 ICS. Med den strukturelle omdannelse af livmodervæv i hele drægtighedsperioden ændres antallet og andelen af livmoderleukocytter også (se figur 2A for et eksempel på variationer i procentdelen af gruppe 1 uILC-delmængder)3,4.
Når mus henvises til i dette papir, menes C57BL/6-stammen af indavlede laboratoriemus. Udavlede mus (f.eks. NMRI-mus) bruges ofte i reproduktiv forskning på grund af deres høje reproduktionshastighed. Men brugen af indavlede stammer er nødvendig for at generere ensartede resultater, og immunologens foretrukne genetiske baggrund er C57BL/6, også kendt som B6.
Ca. 30% af livmoder leukocytter i B6 dæmninger i midten af drægtighedsperioden er g1 uILCs, som er defineret ved flow cytometri som levedygtige CD45 +CD3-CD19-NK1.1+NKp46 + celler (Figur 2B): pro-angiogenic væv-resident NK (trNK), IFN-g producerer konventionelle NK (cNK), og uILC14,5. Procentdelen af uNK-celler er endnu højere hos mennesker og når omkring 70% i første trimester6. Der er flere ligheder end forskelle mellem menneske og mus uNK og uILC7,8. Selv om det er vigtigt at holde forskellene i tankerne, er det nyttigt at integrere de tilgængelige oplysninger om de to arter. Når man kombinerer oplysninger fra undersøgelse af uILC hos mennesker og laboratorie gnavere, er det klart, at NK-celler hjælper med homøostatiske ændringer, der er afgørende for livmoderens biologi, herunder vedligeholdelse af arteriel integritet9 og spiralarterie ombygning10 samt trofoblastinvasion11,12. De spiller også specifikke roller i forsvaret mod patogener13,14. Hos mus og rotter akkumuleres NK-celler ud over at fylde deciduaen omkring implantationsstedet mellem de to muskellag i myometriumet af dæmninger i en forbigående struktur kendt som mesometrielymfoidaggregatet af graviditet (MLAp)15 (Figur 1B), også tidligere kendt som den metriske kirtel, hvis funktion endnu ikke er opdaget.
Beskrevet her er en detaljeret protokol over den metode, der anvendes i laboratoriet til at isolere lymfocytter fra livmoderen af gravide mus ved hjælp af en kombination af mekanisk opdeling og enzymatisk fordøjelse. Da hele livmoderen anvendes i metoden, er lymfocytter isoleret fra livmoderen under svangerskabet en blanding af decidual- og myometrieceller. Yderligere dissektion af decidua fra livmodervæggen og dens MLAp er mulig, og det er blevet beskrevet før16. Den metode, der er beskrevet her, blev udviklet til at opnå livmoderlymfocytter og samtidig bevare proteinoverfladeudtryk, cellulær funktionalitet og levedygtighed. Resultatet er en enkelt celle suspension med minimal resterende cellulære vragrester og et udbytte typisk spænder fra 1-5 millioner celler i midten af svangerskabet (10,5 dage) for en gravid livmoder. Anvendelsen af denne metode omfatter phenotyping ved flowcytometri, cellesortering til efterfølgende transskriptomiske eller proteomiske undersøgelser, funktionelle undersøgelser såsom intracellulær cytokinproduktion, degranulation, ELISPOT- eller cytotoksiske analyser. Den protokol, der præsenteres her fokuserer på at identificere gruppe 1 ICS, men kan tilpasses til andre celletyper såsom andre ILCs, T-celler, B-celler, DC, eller makrofager med mindre ændringer af antistof panel, der anvendes til FACS analyse. Protokollen kan også bruges til at isolere celler fra andre væv og til pooled ikke-gravide uteri.
Metoden indeholder flere kritiske trin, der diskuteres herefter. Det første kritiske skridt er at opnå flere synkrone graviditeter som den relative hyppighed af leukocyt populationer ændringer gennem graviditet. At have flere dæmninger på samme svangerskabsdag giver mulighed for enten biologiske gentagelser i de samme eksperimenter eller samle lymfocytter fra individuelle dæmninger for at opnå større antal, der kræves til downstream applikationer. Timet parring gør det muligt for forskeren at lokalisere undfangelsen inden for en 24 timers periode. Selvom mus lever i omkring 2,5 år, vil de være af reproduktiv alder fra 4-7 uger til 6-8 måneder gamle. Da yngre mus normalt producerer mindre hvalpe, parres hunmus generelt ikke, før de er mellem 6-8 uger, og hanmus, indtil de er mellem 8-10 uger. I betragtning af at østrus varer ca. 15 timer i mus og forekommer hver 4-5 dage, er den typiske parringshastighed (afsløret af et vaginalt stik, se figur 4) omkring 25%. Det er derfor vigtigt at bruge mus i østrus og planlægge et tilstrækkeligt antal til at opnå det nødvendige antal dæmninger til et givet forsøg. Østrus cyklus fase kan bestemmes af vaginal smear cytology22. Stikhastigheden kan forbedres ved at hvile mænd 48 timer før parring og ved at drage fordel af Whitten-effekten18. Alternativt kan man administrere gravid hoppe serum, som efterligner effekten af det endogene follikelstimulerende hormon, fremkalder oocytmodning og 42-50 timer senere human chorionic gonadotropin, som efterligner effekten af det endogene luteiniserende hormon, der fremkalder ægløsning. Denne hormonelle behandling omgår kravet om østrus og gør stort set alle behandlede kvinder modtagelige.
Et andet kritisk skridt er at sikre kvaliteten af FACS farvning. Antistoffer, der anvendes i flowcytometri, skal altid titreres og anvendes ved den optimale koncentration, og det er nødvendigt at kontrollere, at den enzymatiske fordøjelse ikke kløve afgørende antigene epitoper. For at vurdere, om et enzym vil kløve en epitop, kan man plette to fraktioner af den samme prøve parallelt, den ene gennemgår enzymatisk og den anden mekanisk fordøjelse. På samme måde er brugen af passende kontroller og enkelte pletter afgørende for at opnå pålidelige data. For sjældne begivenheder, kan perler bruges til at generere enkelt plet prøver. Det anbefales ikke at bruge perler til opsætning af spændinger, men snarere en population af celler, der indeholder lymfocytter og andre leukocytter, såsom splenocytter. Hvis der anvendes perler, er det nødvendigt at titrere antistoffer til perlefarvning, så fluorescensintensiteten af farvede perler vil kunne sammenlignes med cellernes fluorescensintensitet. I tilfælde af vanskeligheder med at adskille positive fra negative celler for en bestemt markør kan en FMO-kontrol også bruges til at lette gating for en bestemt markør. For intracellulære markører skal der anvendes en isotypekontrol, da intracellulær farvning kan resultere i resterende ubundne antistoffer, som stadig kan være til stede i cellerne efter vasketrinene og derfor øge baggrundssignalet. Det anbefales at køre prøverne inden for 24 timer efter fastsættelse af cellerne for at opnå de bedste resultater i phenotyping ved FACS analyse, som autofluorescence stiger betydeligt over tid og fluorescens intensitet af nogle antistoffer kan falde over tid.
En anden afgørende faktor at overveje er downstream-anvendelsen af den enkeltcellede suspension, der er opnået med protokollen. For funktionelle analyser er det vigtigt at arbejde under sterile forhold. Tilsvarende er det for efterfølgende omics undersøgelser vigtigt at arbejde i steril og RNase, DNase og protease-fri.
Protokollen præsenteres her fokuserer på phenotyping gruppe 1 ICS, men kan tilpasses til phenotyping andre celletyper ved at ændre antistofpanelet. Det anbefales, at alle antistoffer testes mod fordøjet og ikke-fordøjet celleaffjedring for at påvise tab/ændring af overflade epitoper ved enzymatisk behandling. Tilsvarende kan forskellige enzymer bruges til at fordøje vævet og øge celleudbyttet, men dets virkning på afgørende antigene epitoper skal omhyggeligt undersøges. Mens NKp46 er en god markør for milt NK-celler og virker i alle stammer af laboratoriemus, er udtrykket NKp46 på uNK-celler i C57BL/6 mus betydeligt lavere end på milt NK-celler. Det er bedst at plette for både NK1.1 og NKp46 samtidigt. Hvis flere organer skal sammenlignes direkte, anbefales det at behandle alle prøver lige, selvom den enzymatiske fordøjelse ikke er nødvendig for væv som milten eller knoglemarven. Selv om den metode, der præsenteres her gælder for den ikke-gravide livmoder, lymfocyt ring isolation ved en to-faset Percoll gradient vil være udfordrende, og udbyttet af isolerede celler kan være for lavt til pålidelig FACS analyse og derfor vil kræve sammenlægning celler isoleret fra livmoderen af individuelle, ikke-gravide mus23.
Der er begrænsninger i protokollen til at overveje for fortolkningen af dataene. Som det er tilfældet for alle væv, cirkulerende lymfocytter, der kommer fra blodet vil blive isoleret sammen med væv-resident celler. Hvis udelukkelsen af cirkulerende lymfocytter er afgørende for datafortolkning, kan intravital farvning udføres for at mærke cirkulerende celler. Desuden er en anden begrænsning af protokollen, at nogle celler vil gå tabt, da ikke alle celler kan udvindes fra vævet. De mest almindelige problemer og deres fejlfinding præsenteres i tabel 2.
Historisk set har studiet af celler i væv været baseret på histologisk undersøgelse af vævsafsnit. Sandra Peel’s fremragende gennemgang24 opsummerer det arbejde, der er gjort over mere end 100 år indtil slutningen af 80’erne. Beskrivelser af celler senere kendt som uNK celler faktisk vises i manuskripter offentliggjort mere end et halvt århundrede før lymfocytter blev endda opdaget. Så før opdagelsen af NK-celler i 1975, og uNK-cellerne er blevet angivet som moderens glykogenceller eller granulerede metriske kirtelceller. Anne Croy har ydet store bidrag på området25 og venligt undervist holdet dissektion hun havde optimeret3, og det bruges i øjeblikket. Selv om det er medvirkende til at beskrive morfologi og væv placering af uNK celler, klassisk histologisk undersøgelse er begrænset til påvisning af kun et par markører på cellerne af interesse. I 2008 blev en flowcytometribaseret metode til samtidig at opdage flere markører på livmoderlymfocytter beskrevet26. Dette er hovedsagelig den metode, der er blevet beskrevet i dette papir. Nyere teknologier såsom rumlige transskriptomics og billeddannelse ved massecytometri kombinerer kraften i histologi og flowcytometri, hvilket gør det muligt både samtidig påvisning af flere gener eller proteiner og bevarelsen af den normale vævsarkitektur.
Anvendelsen af den metode, der er beskrevet her, er flere og omfatter FACS phenotyping, funktionel analyse (såsom ELISPOT, degranulation eller cytotoksiske assays), celle sortering, og efterfølgende transcriptomics eller proteomics. Yderligere applikationer, der kunne udvikles baseret på denne metode omfatter kultur og udvidelse af decidual NK celler efter celle sortering eller berigelse ved negativ udtømning. I øjeblikket er der ingen protokol til kultur og udvide mus uNK celler og bevare deres levedygtighed og funktionalitet i en længere periode, på samme måde som menneskelige NK celler, der kan dyrkes og udvides i 7-14 dage ved tilsætning af IL-2 eller en kombination IL-12 og IL-15. Optimering af en sådan metode til mus uNK celler ville give mere fleksibilitet, når de udfører funktionelle assays og giver mulighed for flere betingelser, der skal testes med et højere celletal. På den anden side, kultur betingelser er kendt for at ændre den unikke fæmfotype af lymfocytter og potentielt deres funktion også.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker de tidligere og de nuværende teammedlemmer, der har hjulpet med at udvikle denne metode, herunder Jean-Marc Doisne, Norman Shreeve, Iva Filipovic og Anita Qualls. Denne forskning blev finansieret af Wellcome trust [Grant nummer 200841/Z/16/Z] og Medical Research Council (MR/P001092/1). Med henblik på åben adgang har forfatteren anvendt en CC BY-licens til offentlig ophavsret på enhver forfatter accepteret manuskriptversion, der følger af denne indsendelse.
70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | |
BSA | Sigma | A9647-100G | |
CD19 antibody | BD | 562701 | |
CD3 antibody | BD | 562600 | |
CD45 antibody | BioLegend | 103108 | |
CD49a antibody | BD | 740262 | |
DNase I | Roche (Sigma) | 10104159001 | |
EOMES antibody | eBioscience | 12-4875-82 | |
Fc block Trustain fcx | BioLegend | 101320 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10217-106 | |
Fix/Perm buffer (part of BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit) | BD | 554714 | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Gibco | 14025092 | |
Liberase DH | Roche (Sigma) | 5401089001 | |
Lysis buffer Pharmlyse | BD | 555899 | |
NK1.1 antibody | BioLegend | 108739 | |
NKp46 antibody | BioLegend | 137608 | |
Paraformaldehyde 16% Solution (methanol-free) | Agar Scientific | AGR1026 | |
PBS 10x | Gibco | 14030-048 | |
PBS 1x (no Ca2+ or Mg2+) | Thermo Scientific | 14190144 | |
Percoll | VWR international | 17-0891-01 | |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
Pre-Separation filters | Miltenyi | 130-095-823 | |
RMPI-1640 medium + GlutaMAX | Gibco | 61870-010 | |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Scientific | 15575020 | |
Zombie Violet Fixable Viability dye | BioLegend | 423113 |