Улавливание с помощью смолы в сочетании с изобарической маркировкой тандемных масс-меток для мультиплексированной количественной оценки окисления тиола белка

Summary

Окисление белка тиола имеет значительные последствия при нормальных физиологических и патофизиологических условиях. Мы описываем детали количественного метода окислительно-восстановительной протеомики, который использует захват с помощью смолы, изобарическую маркировку и масс-спектрометрию, что позволяет идентифицировать и количественно оценивать обратимо окисленные цистеиновые остатки белков.

Abstract

Обратимые окислительные модификации белковых тиолов недавно стали важными медиаторами клеточной функции. Здесь мы описываем подробную процедуру количественного метода окислительно-восстановительной протеомики, который использует смоляной захват (RAC) в сочетании с изобарической маркировкой тандемной массы (TMT) и жидкостной хроматографией-тандемной масс-спектрометрией (LC-MS / MS), чтобы позволить мультиплексированную стохиометрическую количественную оценку окисленных белковых тиолов на уровне протеома. Количественная информация об окисленных остатках цистеина для конкретных участков дает дополнительное представление о функциональном воздействии таких модификаций.

Рабочий процесс адаптируется ко многим типам образцов, включая культивируемые клетки (например, млекопитающие, прокариоты) и целые ткани (например, сердце, легкие, мышцы), которые первоначально лизируются / гомогенизируются и со свободными тиолами, алкилированными для предотвращения искусственного окисления. Окисленные белковые тиолы затем восстанавливаются и захватываются тиол-аффинной смолой, которая оптимизирует и упрощает этапы рабочего процесса, позволяя выполнять процедуры переваривания, маркировки и промывки без дополнительной передачи белков / пептидов. Наконец, меченые пептиды элюируются и анализируются LC-MS / MS, чтобы выявить комплексные стехиометрические изменения, связанные с окислением тиола во всем протеоме. Этот метод значительно улучшает понимание роли окислительно-восстановительной регуляции при физиологических и патофизиологических состояниях, связанных с окислением белка тиола.

Introduction

В гомеостатических условиях клетки генерируют активный кислород, азот или серу, которые помогают облегчить процессы, такие как метаболизм и передача сигналов ^1,2,3, распространяющихся как на прокариот, так и на эукариот. Физиологические уровни этих реактивных видов необходимы для правильной клеточной функции, также известной как «эустресс»^1,4. Напротив, увеличение окислителей, которое приводит к дисбалансу между окислителями и антиоксидантами, может вызвать окислительный стресс или «дистресс»¹, что приводит к повреждению клеток. Окислители передают сигналы биологическим путям, модифицируя различные биомолекулы, включая белок, ДНК, РНК и липиды. В частности, цистеиновые остатки белков представляют собой высокореакционноспособные участки, склонные к окислению из-за тиольной группы на цистеине, которая является реакционноспособной по отношению к различным типам окислителей⁵. Это приводит к появлению широкого спектра обратимых посттрансляционных модификаций на основе окислительно-восстановительных систем (ПТМ) для цистеина, включая нитрозилирование (SNO), глутатионилирование (SSG), сульфенилирование (SOH), персульфидирование (SSH), полисульфидирование (SS_nH), ацилирование и дисульфиды. Необратимые формы окисления цистеина включают сульфинилирование (SO₂H) и сульфонилирование (SO₃H).

Обратимые окислительные модификации остатков цистеина могут выполнять защитные роли, предотвращающие дальнейшее необратимое окисление, или служить сигнальными молекулами для последующих клеточных путей ^6,7. Обратимость некоторых окислительно-восстановительных ПТМ позволяет цистеиновым сайтам функционировать как «окислительно-восстановительные переключатели»^8,9, при этом изменения в окислительно-восстановительном состоянии этих сайтов изменяют функцию белка для регулирования их роли в переходных процессах. Модулирующие эффекты окислительно-восстановительных ПТМ¹⁰ наблюдались во многих аспектах функции^{белка 11}, включая катализ¹², белково-белковые взаимодействия¹³, изменение конформации¹⁴, координацию ионов металлов¹⁵ или фармакологическое связывание ингибитора¹⁶. Кроме того, окислительно-восстановительные ПТМ участвуют в цистеиновых сайтах белков, которые регулируют такие пути, как транскрипция¹⁷, трансляция¹⁸ или метаболизм¹⁹. Учитывая влияние, которое окислительно-восстановительные ПТМ оказывают на функцию белка и биологические процессы, важно количественно оценить степень окисления, которую подвергается сайт цистеина в ответ на возмущение окислительно-восстановительного состояния.

Идентификация цистеиновых участков с измененными окислительно-восстановительными состояниями сосредоточена на сравнении состояния окисления на сайт-специфическом уровне между нормальными и возмущенными условиями. Измерения изменения складок часто используются для определения того, какие участки значительно изменены, поскольку это помогает пользователям интерпретировать, какие участки цистеина могут быть физиологически значимыми для исследования. В качестве альтернативы, стехиометрические измерения обратимого окисления тиола в конкретном типе образца дают общую картину физиологического состояния в отношении клеточного окисления, что является важным измерением, которое часто упускается из виду и недостаточно используется. Модификационная стехиометрия основана на количественной оценке процента модифицированного тиола в соотношении к общему тиолу белка (модифицированному и немодифицированному)^20,21. В результате стехиометрические измерения предлагают более точное измерение, чем изменение складки, особенно при использовании масс-спектрометрии. Значение увеличения окисления может быть более легко установлено с помощью стехиометрии для определения занятости PTM конкретного участка цистеина. Например, 3-кратное увеличение окисления тиола может быть результатом перехода всего на 1% к 3% или от 30% до 90%. 3-кратное увеличение окисления для участка, который заполняется только на 1%, может оказать незначительное влияние на функцию белка; тем не менее, 3-кратное увеличение для участка с 30% заполняемостью в состоянии покоя может быть более существенным. Стехиометрические измерения, выполняемые между общими окисленными тиолами и специфическими окислительными модификациями, включая глутатионилирование белка (SSG) и нитрозилирование (SNO), могут выявить соотношения и количественную информацию в отношении конкретных типов модификаций.

Поскольку обратимое окисление тиола обычно представляет собой посттрансляционную модификацию с низким содержанием, было разработано несколько подходов для обогащения белков, содержащих эти модификации, из биологических образцов. Ранний подход, разработанный Jaffrey и другими, названный методом переключения биотина (BST)²², включает в себя несколько этапов, на которых немодифицированные тиолы блокируются путем алкилирования, обратимо модифицированные тиолы восстанавливаются до зарождающихся свободных тиолов, зарождающиеся свободные тиолы мечуются биотином, а меченые белки обогащаются сцеплением сродства стрептавидина. Этот метод использовался для профилирования SNO и SSG во многих исследованиях и может быть адаптирован для зондирования других форм обратимого окисления тиола^23,24. В то время как BST использовался для исследования различных форм обратимого окисления тиола, одна из проблем с этим подходом заключается в том, что на обогащение влияет неспецифическое связывание небиотинилированных белков со стрептавидином. Альтернативный подход, разработанный в нашей лаборатории, названный смоляным захватом (RAC)^25,26 (Рисунок 1), обходит вопрос обогащения тиоловых групп с помощью системы биотин-стрептавидин.

После восстановления обратимо окисленных тиолов белки с зарождающимися свободными тиолами обогащаются тиол-аффинной смолой, которая ковалентно захватывает свободные тиольные группы, что позволяет более специфическо обогащать цистеинсодержащие белки, чем BST. Соединение RAC с мультиплексирующей способностью последних достижений изобарической маркировки и масс-спектрометрии создает надежный и чувствительный рабочий процесс для обогащения, идентификации и количественной оценки обратимо окисленных остатков цистеина на уровне протеома. Последние достижения в области масс-спектрометрии позволили гораздо глубже профилировать тиоловый окислительно-восстановительный протеом, повышая понимание как причины, так и следствия окисления белка тиола²⁷. Информация, полученная на основе количественных данных по конкретным участкам, позволяет проводить дальнейшие исследования механистических воздействий и последующих эффектов обратимых окислительных модификаций²⁸. Использование этого рабочего процесса дало представление о физиологических последствиях обратимого окисления цистеина в отношении нормальных физиологических событий, таких как старение, при этом уровни SSG различались в зависимости от возраста. Эффекты старения на SSG были частично обращены вспять с помощью SS-31 (эламипретид), нового пептида, который усиливает митохондриальную функцию и снижает уровень SSG у пожилых мышей, в результате чего у них профиль SSG, более похожий на молодых мышей²⁹.

Было показано, что патофизиологические условия, связанные с воздействием наночастиц, включают SSG в модель макрофагов мыши. Используя RAC в сочетании с масс-спектрометрией, авторы показали, что уровни SSG напрямую коррелируют со степенью окислительного стресса и нарушения фагоцитарной функции макрофагов. Данные также выявили специфические для пути различия в реакции на различные инженерные наноматериалы, которые вызывают различные степени окислительного стресса³⁰. Метод также доказал свою полезность при прокариотических видах, где он применялся для изучения влияния суточных циклов на фотосинтетические цианобактерии в отношении окисления тиола. Наблюдались широкие изменения в окислении тиола в нескольких ключевых биологических процессах, включая перенос электронов, фиксацию углерода и гликолиз. Кроме того, с помощью ортогональной валидации было подтверждено, что несколько ключевых функциональных участков были модифицированы, что свидетельствует о регуляторной роли этих окислительных модификаций⁶.

Здесь мы описываем детали стандартизированного рабочего процесса (рисунок 1), демонстрируя полезность подхода RAC для обогащения общих окисленных цистеиновых тиолов белков и их последующей маркировки и стехиометрической количественной оценки. Этот рабочий процесс был реализован в исследованиях окислительно-восстановительного состояния в различных типах образцов, включая клеточные культуры^27,30 и целые ткани (например, скелетные мышцы, сердце, легкие)29,31,32,33. Хотя протокол RAC не включен здесь, он также легко адаптируется для исследования конкретных форм обратимых окислительно-восстановительных модификаций, включая SSG, SNO и S-ацилирование, как упоминалось ранее 25,29,34.

Protocol

Все процедуры, описанные в протоколе, связанные с образцами/тканями животных или человека, были одобрены и соответствовали институциональным руководящим принципам Комитета по этике исследований человека и животных. 1. Гомогенизация/лизис образцов Замороженные об?…

Representative Results

Завершение протокола приведет к высокоспецифичному обогащению ранее окисленных цистеинсодержащих пептидов, часто со специфичностью >95% 27,35,36. Однако несколько ключевых этапов протокола требуют особого внимания, например, первоначаль…

Discussion

Улавливание с помощью смолы использовалось в различных типах образцов и биологических системах для исследования окислительных модификаций остатков цистеина 25,29,30. Этот метод позволяет оценивать образцы на нескольких уровнях и показ?…

Materials

2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride	Med Chem Express	HY-101794	Reagent for in-house resin synthesis
2.0 mL LoBind centrifuge tubes	Eppendorf	22431048
5.0 mL LoBind centrifuge tubes	Eppendorf	30108310
5.0 mL round bottom tubes	Falcon	352054
Acetone	Fisher Scientific	A949-1
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998
Activated Thiol–Sepharose 4B	Sigma Aldrich	T8512	Potential replacement for thiol-affinity resin
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter	Millipore Sigma	UFC5010BK
Ammonium bicarbonate	Sigma Aldrich	09830
Bicinchonicic acid (BCA)	Thermo Scientific	23227	Protein Assay Reagent
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	20291
EDTA	Sigma Aldrich	E5134
HEPES buffer	Sigma Aldrich	H4034
Homogenizer	BioSpec Products	985370
Iodoacetimide (IAA)	Sigma Aldrich	I1149
N-ethylmaleimide	Sigma Aldrich	4259
NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow	Cytiva	17-0906-01	Reagent for in-house resin synthesis
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S3014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L6026
Sonicator	Branson	1510R-MT
Spin columns	Thermo Scientific	69705
Strata C18-E reverse phase columns	Phenomenex	8B-S001-DAK	Peptide desalting
Thermomixer	Eppendorf	5355
Thiopropyl Sepharose 6B	GE Healthcare	17-0420-01	Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).
TMT isobaric labels (16 plex)	Thermo Scientific	A44522	Peptide labeling reagent; available in multiple formats
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)	Sigma Aldrich	T7408
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma Aldrich	T6508
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsin	Promega	V5820
Urea	Sigma Aldrich	U5378
Vacufuge Plus speedvac	Eppendorf	22820001	vacuum concentrator
Vortex mixer	Scientific Industries	SI-0236