Intercambio de hidrógeno/deuterio basado en electroforesis capilar para la caracterización conformacional de proteínas con espectrometría de masas de arriba hacia abajo

Summary

Aquí se presenta un protocolo para un enfoque de intercambio de hidrógeno / deuterio (HDX) basado en electroforesis capilar junto con espectrometría de masas de arriba hacia abajo. Este enfoque caracteriza la diferencia en las estructuras de orden superior entre diferentes especies de proteínas, incluidas proteínas en diferentes estados y diferentes proteoformas, mediante la realización de HDX diferencial concurrente y separación electroforética.

Abstract

Resolver la heterogeneidad conformacional de múltiples estados proteicos que coexisten en solución sigue siendo uno de los principales obstáculos en la caracterización de la terapéutica proteica y la determinación de las vías de transición conformacional críticas para las funciones biológicas, que van desde el reconocimiento molecular hasta la catálisis enzimática. La reacción de intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX) junto con el análisis espectrométrico de masas (MS) de arriba hacia abajo proporciona un medio para caracterizar las estructuras y dinámicas de orden superior de proteínas de una manera específica del conformador. El poder de resolución conformacional de esta técnica depende en gran medida de la eficiencia de separar los estados de proteína a nivel de proteína intacta y minimizar el contenido protico residual no deuterado durante las reacciones HDX.

Aquí describimos una variante basada en electroforesis capilar (CE) del enfoque HDX MS que tiene como objetivo mejorar la resolución conformacional. En este enfoque, las proteínas experimentan reacciones HDX mientras migran a través de una solución de electrolito de fondo deuterado (BGE) durante la separación electroforética capilar. Los diferentes estados de proteínas o proteoformas que coexisten en solución se pueden separar de manera eficiente en función de sus diferentes proporciones de carga a tamaño. La diferencia en la movilidad electroforética entre las proteínas y las moléculas de disolvente prótico minimiza el disolvente residual no deuterado, lo que resulta en un entorno de deuteratización casi completo durante el proceso HDX. La interfaz CE-MS microvial de flujo continuo permite una ionización electrospray eficiente de las especies de proteínas eluidas después de una rápida mezcla con la solución modificadora de enfriamiento y desnaturalización en la salida del pulverizador. El análisis de EM de arriba hacia abajo en línea mide el nivel de deuteración global de las especies de proteínas intactas eluidas y, posteriormente, la deuteración de sus fragmentos en fase gaseosa. Este artículo demuestra este enfoque en HDX diferencial para sistemas, incluidas las variantes de proteínas naturales que coexisten en la leche.

Introduction

Distinguir las especies de proteínas en diferentes estados conformacionales, de unión o modificación y caracterizar sus diferencias estructurales es importante para monitorear las vías de transición entre estas especies involucradas en eventos biológicos, que van desde el reconocimiento molecular hasta la catálisis enzimática, y comprender los mecanismos subyacentes a estos eventos. Las técnicas biofísicas convencionales no proporcionan una solución completa debido a las limitaciones como la resolución insuficiente y la pérdida de información dinámica en la solución. El intercambio hidrógeno/deuterio junto con la espectrometría de masas (HDX MS) es una técnica que etiqueta las características estructurales y conformacionales de las proteínas con deuterio (²H) a través del intercambio entre átomos de hidrógeno lábil de proteínas y ²H de la solución ²H₂O introducida deliberadamente. Los protones involucrados en el enlace de hidrógeno o que están secuestrados del disolvente en el interior de la proteína no se intercambian fácilmente¹. Por lo tanto, como el tipo de cambio en un sitio intercambiable depende en gran medida de su participación en estructuras de orden superior, las estructuras de proteínas pueden ser reveladas a alta resolución espacial por MS que sondea la extensión y la tasa de ^{absorción de 2}H en función de las diferentes masas atómicas entre ¹H y ²H. En las últimas décadas, HDX MS se ha convertido en una técnica extraordinariamente exitosa para estudiar conformaciones y dinámicas de proteínas².

En el enfoque clásico de abajo hacia arriba de HDX MS, el conjunto de especies de proteínas en diferentes estados conformacionales, de unión o modificación se proteoliza sin separación a nivel de proteína intacta, lo que hace inviable caracterizar especies individuales mediante el análisis de los fragmentos proteolíticos resultantes con contenido de deuterio enrevesado. En contraste, en el enfoque de arriba hacia abajo, diferentes estados de proteínas o proteoformas que han incorporado diferentes contenidos de deuterio dan lugar a múltiples distribuciones de masas de proteínas intactas en una exploración de EM. Esto permite separar especies individuales mediante la selección masiva de iones correspondientes a cada distribución de masa utilizando un filtro de masa adecuado (como un cuadrupolo) y la caracterización de sus diferencias conformacionales en el posterior análisis de EM en tándem 3,4,5,6. Sin embargo, la eficiencia de separar los estados proteicos o proteoformas en esta estrategia está limitada por el grado de diferencia en sus correspondientes distribuciones de masa.

La electroforesis capilar (CE) proporciona un medio para separar las especies de proteínas en función de sus diferentes cargas y tamaños hidrodinámicos en la fase de solución con alta eficiencia⁷. La combinación de CE con HDX ofrece una separación adicional de los estados proteicos o proteoformas en la fase de solución. Además, el pequeño volumen del capilar CE permite la utilización de una solución totalmente deuterada como solución electrolítica de fondo (BGE), es decir, el tampón en funcionamiento, lo que hace que el capilar sea un reactor HDX para muestras de proteínas. Debido a la diferencia en la movilidad electroforética entre las proteínas y los reactivos próticos en el proceso de electroforesis, la realización de HDX durante la CE da como resultado un entorno de deuteratización casi completo para los analitos de proteínas con un contenido residual no deuterado mínimo, mejorando así la sensibilidad del análisis estructural utilizando datos hdx. Como tal, desarrollamos un enfoque HDX diferencial basado en CE junto con MS de arriba hacia abajo para caracterizar las estructuras de orden superior de proteínas de una manera específica de estado o proteoforma⁸.

Este documento describe los protocolos para este enfoque detallando los pasos de preparación de materiales, procedimientos experimentales y análisis de datos. Los factores que pueden afectar el rendimiento del método o la calidad de los datos se enumeran en notas cortas. Los resultados representativos aquí presentados incluyen datos diferenciales de HDX de mezclas de diferentes proteínas y variantes naturales de β-lactoglobulina bovina (β-lg), la principal proteína de suero presente en la leche⁹. Demostramos eficiencia de separación, reproducibilidad y rendimiento de etiquetado ²H de las dos variantes abundantes de β-lg, es decir, A y B^10,11 durante el HDX basado en CE y la caracterización específica de variantes de sus conformaciones.

Protocol

NOTA: Utilice reactivos de grado de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o grado MS siempre que sea posible para minimizar los contaminantes que pueden interferir con el análisis de EM. No toque la interfaz CE-MS con las manos desnudas durante la medición para evitar la posibilidad de una descarga eléctrica causada por el voltaje electroforético o el voltaje electrospray. 1. Preparación del material Modificación del capilar de sílice fundida para CE Prepa…

Representative Results

El cambio de la presión de infusión de BGE permite ajustar tanto la eficiencia de separación como el tiempo de migración, lo que equivale al tiempo de reacción HDX de las proteínas a separar (Figura 3). Una presión de infusión más baja da como resultado una mejor separación de los picos de CE a costa de la duración del experimento (Figura 3A). Un tiempo de reacción de migración/HDX más largo da como resultado un mayor nivel de deuteración de los a…

Discussion

Los objetivos del recubrimiento de la pared interna del capilar CE incluyen la minimización del flujo electroosmótico y la absorción de proteínas durante el proceso CE¹³. Aunque el flujo electroosmótico es beneficioso para el análisis CE convencional de moléculas pequeñas debido a su capacidad de conducir especies neutras o con carga opuesta al detector, compromete la eficiencia de separación de especies de proteínas con tamaños similares y cargas netas en solución. El recubrimiento de…

Materials

ammonium acetate	Fisher Chemical	A/3446/50	≥99%
CESI 8000 plus capillary electrophoresis system	Sciex, USA
centrifuge	Eppendorf	5406000097
centrifugal filter	Merck	UFC201024	10 kDa cutoff
deuterium oxide	Energy Chemical	E090001	99.9 % D
formic acid	Acros Organics	270480250
fused silica glass capillary	Polymicro Technologies	1068150017	ID 50μm, OD 360μm
gas chromatography	Agilent	GC6890N
hydrochloric acid	Sigma Aldrich	258148
hydroxypropyl cellulose	Aladdin	H113415	MW 100000
magnetic stirrers	DLAB	8030101212
methanol	Fisher Chemical	A456-4	MS grade
microvolume UV-Vis spectrophotometer	DeNovix	84677JK7731
myoglobin	Sigma Aldrich	M1882
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific, USA
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System	Beckman Coulter, USA
Q Exactive UHMR mass Spectrometer	Thermo Fisher Scientific, Germany
sodium hydroxide	Sigma Aldrich	S5881
ubiquitin	Sigma Aldrich	U6253
ultrasonicator	SCIENTZ	SB-5200
β-lactoglobulin	Sigma Aldrich	L0130