이 기사에서는 1차 및 불멸화 세포주에서 UV 방사선 및 화학 독소의 독성을 평가하는 데 사용되는 절차를 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 기사에서는 일차(pHCEC) 및 불멸화(iHCEC) 인간 각막 상피 세포 배양에서 자외선(UV) 방사선 및 안구 독소의 독성을 측정하는 방법을 설명합니다. 세포는 UV 방사선 및 독성 용량의 염화벤잘코늄(BAK), 과산화수소(H2O2) 및 황산나트륨(SDS)에 노출되었습니다. 대사 활성은 대사 분석을 이용하여 측정하였다. 염증성 사이토카인의 방출은 multi-plex interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-8 및 tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) assay를 이용하여 측정하였으며, 형광 염료를 이용하여 세포 생존율을 평가하였다.
세포 대사 활성 및 사이토카인 방출에 대한 UV의 손상 효과는 iHCEC에 대한 UV 노출 5분 및 pHCEC에 대한 UV 노출 20분에서 발생했습니다. iHCEC 및 pHCEC의 대사 활성의 유사한 퍼센트 감소는 BAK,H2O2, 또는 SDS에 노출된 후에 발생하였고, 사이토카인 방출의 가장 유의한 변화는 IL-6 및 IL-8에 대해 발생하였다. 형광으로 염색된 iHCEC 및 pHCEC BAK에 노출된 세포의 현미경은 0.005% BAK 노출에서 세포 사멸을 나타내었지만, 에티듐 염색의 정도는 pHCEC보다 iHCEC에서 더 컸습니다. 현미경을 사용하여 독성 효과를 평가하는 여러 방법, 대사 활성 평가 및 사이토카인 생산을 활용하여 UV 방사선 및 화학 독소의 독성을 1차 및 불멸화 세포주 모두에 대해 측정할 수 있습니다.
서론
체외 독성학 연구는 세포에 손상을 줄 수있는 화학 물질 및 기타 물질의 독성 영향을 예측하기 위해 수행됩니다. 각막에 대한 독성의 평가에서, 인간 각막 상피 세포 (HCECs)는 이들 효과를 평가하기 위한 모델에 사용되었다 1,2,3,4. 이러한 모델은 일반적으로 세포의 대사 활동, 세포 증식 및 염증성 사이토카인의 생성 및 방출과 같은 기타 세포 기능의 변화와 같은 생리학적 효과를 평가합니다. 이러한 독성학 연구를 위해 HCEC에 대한 화학 물질 및 UV 방사선의 손상 효과를 평가하기 위해 다양한 출처의 세포가 선택되었습니다 2,3. pHCEC 라인은 성인의 공여자 조직으로부터 이들 세포를 제공하는 회사로부터 입수가능하다. 일차 세포는 디스파아제로 처리하고 배양을 위해 각막을 부드럽게 긁어낼 수 있다5. 그런 다음 세포는 바이러스 및 오염에 대해 테스트한 다음 10% 디메틸 설폭사이드에 냉동 보존된 상....
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프로토콜
1. pHCEC 및 iHCEC의 배양
- 다음 보충제를 사용하여 인간 안구 상피 배지(HOEM)에서 pHCEC 및 iHCEC를 성장시킵니다: 6mM L-글루타민, 0.002% 세포 배지 보충제 O(재료 표), 1.0μM 에피네프린, 0.4% 세포 배지 보충제 P(재료 표), 콜라겐-1 코팅 배양 플라스크에서 5μg/mL rh 인슐린, 5μg/mL 아포-트랜스페린 및 100ng/mL 히드로코르티손 헤미숙시네이트(75cm2 배양 플라스크에서 18mL).
- 세포가 ~80% 합류점으로 성장한 후 배지를 제거하여 플라스크의 배지를 2-3일마다 교체합니다. 페놀 레드가 없는 해리 용액을 추가하고 세포가 완전히 분리될 때까지 플라스크를 37°C에서 배양합니다. DMEM/F12로 해리 용액을 혈청으로 중화한 다음 500× g에서 세포를 원심분리합니다. 상청액을 배지를 제거하고 HOEM 배지에서 세포를 재현탁합니다.
2. 컨포칼 현미경을 이용한 세포 크기 측정
- pHCEC와 iHCEC를 1mL의 HOEM과 함께 1 × 105 농도의 유리 바닥 커버슬립이 있는 콜라겐 코팅된 페트리 접시에 ....
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결과
셀 크기
1차 및 불멸화된 HCEC는 세포 생존력의 세 가지 다른 단계를 반영하는 세 가지 형광 염료로 시각화되었습니다. 살아있는 세포는 녹색(calcein-AM), 죽은 세포는 빨간색(ethidium homodimer-1), 세포사멸 세포는 노란색(형광 신호의 더 나은 시각화를 위해 annexin V-computer-adjusted color)입니다. 살아있는 세포는 세포 세포질에 에스테라아제를 포함하고 칼세인-AM을 칼세인으로 전환합니다. 죽은 세포에는 에티듐 호모다이머-1을 투과할 수 있는 세포막이 있습니다. 세포사멸 세포는 포스파티딜세린이 외막으로 전위됨에 따라 세포막에서 염색됩니다.
두 가지 유형의 HCEC에 대한 세포 크기 비교는 그림 1과 같이 24시간 및 48시간 성장 후 컨포칼 현미경을 사용하여 이루어졌습니다. iHCEC(그림 1A
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토론
두 가지 유형의 HCEC 사용의 잠재적 차이를 평가했습니다. 세포를 동일한 농도의 세포로 동일한 배지(HOEM)에 배치한 다음 단기간 및 장기간의 UV 방사선과 3개의 안구 독소에 노출시켰습니다. UV 방사선 및 화학 물질의 선량은 생리학적 효과에 따라 선택되었으며, 이는 비교할 수 있는 중간 반응을 생성하기에 세포에 충분히 손상을 입혔습니다. UV 방사선에 대해 5 및 20 분의 노출 시간 및 BAK (0.001 %), SDS (0.0025 %), 및H2O2(0.01 %)의 선택된 용량에 대해 5 및 15 분의 노출 시간은 세포와 처리되지 않은 대조군 사이에 유의하게 상이한 반응을 나타내는 이상적인 노출 시간 및 농도였다.
HOEM은 HCEC 배양에 최적화된 무혈청 배지입니다. HOEM은 일차 세포와 불멸화 세포의 성장을 지원합니다. 본 조사에 사용된 불멸화 세포주는 SV408을 사용하여 불멸화하.......
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공개 사항
저자인 Lyndon W. Jones는 지난 3년 동안 CORE를 통해 Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J&J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage 및 Visioneering으로부터 연구 지원 또는 강의 명예를 받았습니다. Lyndon Jones는 Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis 및 Ophtecs의 컨설턴트 및/또는 자문 위원회에서 활동하고 있습니다. 다른 저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 이 작업에 대한 자금을 받지 못했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 75 cm2 벤티드 플라스크 | 코닝 | 354485 | 이것은 BioCoat 브랜드, 콜라겐 코팅 |
| 96웰 플레이트 | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin 염색 완충 용액 | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, | ||
| Axiovert 100 현미경 510 시스템 | Carl Zeiss Inc., 독일 | ||
| Corning 48 웰 플레이트 | Corning | 354505 | 이것은 BioCoat 브랜드, 콜라겐 코팅 |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | 280 - 700 nm에서 형광을 읽을 수 있습니다 (분석의 경우 540/590) |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| 유리 바닥 커버슬립 | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | Dr. M. Griffith(Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada)의 SV40 불멸화 인간 각막 상피 세포는 Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA를 특성화했습니다. 세포주에서 구성된 기능적 인간 각막 등가물. 과학. 1999년; 286:2169-72. |
| 다음과 같은 보충 교재를 갖춘 인간 안구 상피 매체 (HOEM) : | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | 6 mM L-글루타민, 0.002 % EpiFactor O (기사의 세포 매체 보충 O)로 보충 된 Epigro 기본 매체, 1.0 μ M 에피네프린, 0.4% EpiFactor P (기사의 세포 배지 보충제 P), 5 μ g/mL rh 인슐린, 5 μ 콜라겐-1 코팅 배양 플라스크에 담긴 g/mL Apo-트랜스페린 및 100ng/mL 하이드로코르티손 헤미숙시네이트(BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x 농도이므로 각 99mL의 배지에 1mL를 첨가 |
| Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, | USA SCCE016 | |
| SpectraMax 형광 멀티웰 플레이트 리더 | Molecular Devices, 미국 | ||
| TrypLE Express (cell dissoci solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
참고문헌
- McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
- Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J.
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재인쇄 및 허가
