Dendritiska spines är viktiga cellulära egenskaper i nervsystemet. Här beskrivs levande avbildningsmetoder för att bedöma strukturen och funktionen hos dendritiska ryggar i C. elegans. Dessa tillvägagångssätt stöder utvecklingen av mutanta skärmar för gener som definierar dendritisk ryggradsform eller funktion.
Dendritiska spines är specialiserade platser för synaptisk innervation modulerad av aktivitet och fungerar som substrat för inlärning och minne. Nyligen har dendritiska ryggar beskrivits för DD GABAergiska neuroner som ingångsställen från presynaptiska kolinerga neuroner i motorkretsen av Caenorhabditis elegans. Denna synaptiska krets kan nu fungera som en kraftfull ny in vivo-modell av ryggradsmorfogenes och funktion som utnyttjar den facila genetiken och den färdiga tillgängligheten hos C. elegans till levande cellavbildning.
Detta protokoll beskriver experimentella strategier för att bedöma DD-ryggradens struktur och funktion. I detta tillvägagångssätt används en superupplöst bildstrategi för att visualisera de invecklade formerna av aktinrika dendritiska ryggar. För att utvärdera DD-ryggradsfunktionen stimulerar det ljusaktiverade opsinet, Chrimson, de presynaptiska kolinerga neuronerna, och kalciumindikatorn, GCaMP, rapporterar de framkallade kalciumtransienterna i postsynaptiska DD-spines. Tillsammans omfattar dessa metoder kraftfulla metoder för att identifiera genetiska determinanter för dendritiska ryggar i C. elegans som också kan styra ryggradens morfogenes och funktion i hjärnan.
Dendritiska spines är specialiserade cellulära strukturer som tar emot input från närliggande neuroner för synaptisk överföring. Aktivering av neurotransmittorreceptorer höjer intracellulära kalcium- och nedströms signalvägar i dessa karakteristiska neuronala utsprång1. På grund av den grundläggande betydelsen av dendritiska spines för neurotransmission och deras felreglering i neurodevelopmental sjukdomar1, är upptäckten av faktorer som modulerar dendritisk ryggradsmorfogenes och funktion av stort intresse för neurovetenskapens område.
Nyligen har dendritiska ryggar identifierats i C. elegans nervsystem baserat på viktiga egenskaper som delas med däggdjurs ryggar2. Denna bestämning är avgörande eftersom den öppnar möjligheten att utnyttja fördelarna med C. elegans för att undersöka ryggradsbiologi. Dendritiska ryggar på dorsala D (DD) motorneuroner får input från kolinerga neuroner (VA och VB) i ventral nervkabel (figur 1A)2,3,4. Här presenteras avbildningsmetoder för att utforska strukturen hos DD-dendritiska ryggar och deras funktion in vivo i ett intakt nervsystem som är lättillgängligt för levande avbildning och genetisk analys. För övervakning av formen av dendritiska spines, (1) cytosoliska fluorescerande proteiner, som fyller den dendritiska processen och ryggraden; (2) membranbundna fluorescerande proteiner, som dekorerar gränsen för dendritiska spines och dendriter; eller (3) aktinmarkörerna, LifeAct5 eller Utrophin6, som är berikade i dendritiska ryggar används, vilket avslöjar deras form. För att övervaka funktionaliteten hos DD-spines används GCaMP-fluorescens för att detektera Ca++-transienter som framkallas genom aktivering av det rödförskjutna opsinet, Chrimson, i presynaptiska kolinerga neuroner7. Båda strategierna förväntas underlätta studien av DD-dendritiska ryggar hos vilda och muterade djur.
Airyscan-detektorn valdes för att få ögonblicksbilder av DD-ryggar eftersom den ger ett högre signal-brusförhållande och bättre upplösning än konventionella konfokalmikroskop19,20. AiryScan-avbildning tillåter också användning av konventionella fluorescerande proteiner (t.ex. GFP, mCherry, etc.), nu allmänt tillgängliga för C. elegans. Även om bilder med högre upplösning kan erhållas med andra superupplösningsmetoder (t.ex. STORM, STED, PALM), kräver dessa metoder fotoaktiverbara eller fotoomkopplingsbara fluorescerande proteiner21. Som ett alternativ till Airyscan rekommenderas konventionella konfokalmikroskop. Till exempel uppnår avbildning med Nyquist-förvärv (figur 3) pixelstorleken med ett 40x / 1.3-mål på 123,9 nm, tillräckligt för att skilja de ryggradsmorfologiska typerna (figur 2).
För bestämning av ryggradstätheten rekommenderas användning av ett cytosoliskt fluorescerande protein såsom (1) mCherry eller GFP, (2) LifeAct för att märka aktincytoskeletten eller (3) ett myristoylerat fluorescerande protein (t.ex. MYR::mRuby) för att märka plasmamembranet (figur 1B). Som jämförelse minskar det F-aktinbindande proteinet Utrophin ryggradstätheten (figur 1C), vilket indikerar en negativ effekt på ryggradsmorfogenesen när Utrophin är överuttryckt.
De nuvarande avbildningsmetoderna bör hjälpa till att identifiera genetiska varianter som styr ryggradsmorfologin 1,16. DD-ryggradsmorfologi (dvs. tunn/svamp, filopodial, stubbig, grenad, se figur 2) kan bedömas från enstaka 2D-projektioner av de ventrala nervkabelns laterala bilder eftersom de flesta DD-ryggar antar en karakteristiskt ventralt riktad orientering. I dessa jämförelser är det viktigt att använda samma fluorescerande markör för varje tillstånd eftersom uppenbara ryggradsmorfologiska typer verkar påverkas av märkningsmetoden (t.ex. MYR::mRuby vs. LifeAct::GFP). Dessutom noterades att ryggformerna är dynamiska och sannolikt ändrar form som svar på de yttre signalerna 2,16. Således är det också viktigt att jämföra ryggradsformer mellan genotyper i liknande utvecklingsstadier och under liknande förhållanden.
Orienteringen av C. elegans ventrala sladd är kritiskt avgörande för korrekt bildförvärv. Både ventrala och dorsala sladdar på motsatta sidor av djuret ska vara synliga i samma Z-plan, vilket indikerar att masken är orienterad på sin sida (Figur 1B). Det är bäst att inte samla bilder av maskar som rör sig eller kommer i kontakt med andra maskar eller bubblor nära ventralkabeln, eftersom detta kan försämra bilder av spines.
För kalciumavbildning in vivo måste färska objektglas beredas omedelbart före varje förvärv. Det är bäst att avbilda maskar i kontakt med endast tunna limfibrer vs. “globs” av lim som tenderar att torka maskar och försämra bilden (figur 4B). I experimentet som visas i figur 4 aktiverar pulsen på 561 nm ljus hela synfältet. För att öka den tidsmässiga och rumsliga upplösningen för att detektera lokala Ca++ -transienter, till exempel inom enskilda DD-ryggar, kan en galvo-miniskanner som ställts in för 561 nm-laserlinjen användas för att stimulera ett mindre område av intresse17.
The authors have nothing to disclose.
Avbildning och analys på Imaris utfördes i Vanderbilt Cell Imaging Shared Resource (CIRS) som stöds av NIH (CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 och EY08126). LSM 880 stöds av bidrag 1S10OD201630. Avbildning på en Nikon-spinnskiva utfördes vid Nikon Center of Excellence. Vi tackar Jenny Schafer, CISR-chef, och Bryan Millis för utbildning och insiktsfulla diskussioner och medlemmar i Burnette-labbet: Dylan Burnette, Aidan Fenix och Nilay Taneja för råd. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-bidrag till DMM (R01NS081259 och R01NS106951) och ett American Heart Association-bidrag till ACC (18PRE33960581).
All-trans retinal (ATR) | Sigma-Aldrich | R2500-100MG | Necessary cofactor for neuronal excitation with Chrimson |
diH2O | MilliQ | To prepare M9 buffer | |
Ethanol 100% | Sigma | 64-17-5 | To dilute ATR and make control plates for neuronal excitation |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (tricaine) | To immobilize animals for imaging dendritic spines | ||
ImageJ | NIH | (Schindelin J et al., 2012) | Open source image processing software |
KH2PO4 | Fisher Bioreagents | 7758-11-4 | To prepare M9 buffer |
Levamisole hydrochloride | Sigma | 16595-80-5 | To immobilize animals for imaging dendritic spines |
MgSO4 | Fisher Chemical | M63-500 | To prepare M9 buffer |
Microscope cover glass | Fisherbrand | 12542B | To mount animals for microscopy acquisition |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S369-500 | To prepare M9 buffer |
NaCl | Fisher Chemical | S671-3 | To prepare M9 buffer |
NIS Elements version 05.21 | Nikon | To analyze images and movies (e.g., Deconvolution, image alignment) | |
Polybeads carboxylate 0.05um microspheres | Polysciences, Inc | 15913-10 | To immobilize animals for imaging Ca++ transients |
Prism | For statistical analysis and graphing normalized Ca++ transients | ||
SeaKen ME agarose | Lonza | 50014 | To make agarose pads to mount animals for imaging |
Super Glue | The gorilla company | To immobilize animals for imaging Ca++ transients | |
Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 22-034-980 | To mount animals for microscopy acquisition |
vaseline | Covidien | 8884430300 | To seal sample for confocal snapshots |
Wax | Fisherbrand | 23-021-399 | Paraplast tissue embedding medium |
Microscope for super-resolution imaging | |||
LSM880 | Zeiss | ||
AiryScan detector | Zeiss | ||
Plan Apochromat (oil) 63x/ 1.40 NA, WD = 0.19 mm | |||
Laser lines | |||
Stage controller | |||
Microscope for Nyquist image acquisition | |||
A1R Confocal | Nikon | ||
Plan Fluor (oil) 40x/1.3 NA, WD 0.24 mm | |||
488 nm, 16mW | |||
561 nm, 17mW | |||
Microscope to monitor evoked Ca++ transients in dendritic spines | |||
Spinning Disk Confocal | Nikon | ||
Andor DU-897 EMCCD camera | |||
Spinning disk Head CSU-X1 | Yokogawa | ||
Apo TIRF (oil) 100x/1.49 NA ,WD 0.12 mm | |||
488 nm, 65mW | |||
561 nm, 86mW | |||
525 nm (+/- 18 nm) | |||
605 nm (+/- 35 nm) |