Nukleär migration i Drosophila Oocyte

Summary

I Drosophilagenomgår oocytekärnan mikrotubuleberoende migration under oogenes. Här beskriver vi ett protokoll som utvecklades för att följa migreringen genom att utföra levande avbildning på äggkammare ex-vivo. Vår procedur upprätthåller äggkammare levande i 12 h för att förvärva flerpositions 3D-timelapse-filmer med spinndiskkonfokal mikroskopi.

Abstract

Levande celltomografi är särskilt nödvändigt för att förstå de cellulära och molekylära mekanismer som reglerar organellrörelser, cytoskeletonomorganiseringar eller polaritetsmönster i cellerna. När man studerar oocytkärna positionering, live-imaging tekniker är avgörande för att fånga de dynamiska händelserna i denna process. Drosophila äggkammare är en multicellulär struktur och ett utmärkt modellsystem för att studera detta fenomen på grund av dess stora storlek och tillgänglighet av många genetiska verktyg. Under Drosophila mid-oogenesis migrerar kärnan från en central position inom äggoiden för att anta en asymmetrisk position medierad av mikrotubule-genererade krafter. Denna migration och positionering av kärnan är nödvändiga för att bestämma embryots polaritetsaxlar och den efterföljande vuxna flugan. En egenskap hos denna migrering är att den förekommer i tre dimensioner (3D), vilket skapar en nödvändighet för live-avbildning. För att studera mekanismerna som reglerar nukleär migration har vi därför utvecklat ett protokoll för att odla de dissekerade äggkamrarna och utföra levande avbildning i 12 timmar genom timelapse-förvärv med spinndiskkonfokal mikroskopi. Sammantaget tillåter våra förhållanden oss att bevara Drosophila äggkammare levande under en lång tid, vilket gör det möjligt att slutföra nukleär migration i ett stort antal prover i 3D.

Introduction

I flera år har Drosophila-äggoiden dykt upp som ett modellsystem för att studera nukleär migration. Drosophila oocyte utvecklas i en multicellulär struktur som kallas äggkammaren. Äggkammare omfattar 16 könsceller (15 sjuksköterskeceller och oocyt) omgivna av ett epiteliallager av follikulära somatiska celler. Äggkammarutvecklingen har delats in i 14 steg (figur 1A), under vilken äggcellen kommer att växa och ackumulera reserver som är nödvändiga för embryots tidiga utveckling. Under utvecklingen, vid mikrotubule omorganisering och asymmetrisk transport av moderns bestämningsfaktorer, polariseras oocyten längs antero-dorsala och dorso-ventrala axlar. Dessa axlar bestämmer embryots och den vuxnas efterföljande polaritetsaxlar som härrör från befruktningen av denna oocyt¹. Under oogenes antar kärnan en asymmetrisk position i äggcellen. I steg 6 är kärnan centrerad i cellen. Vid en ännu inte identifierad signal som avges av de bakre follikulära cellerna och som tas emot av äggcellen migrerar kärnan mot skärningspunkten mellan de främre och laterala plasmamembranen i steg 7 (figur 1B)^2,3. Denna asymmetriska position krävs för att inducera bestämningen av dorso-ventralaxeln.

Figur 1: Drosophila melanogaster äggkammare. (A) Fast ovariole från transgena flugor som uttrycker Fs(2)Ket-GFP som märker de nukleära kuvert och ubi-PH-RFP som märker plasmamembranen. Ovariolen består av att utveckla äggkammare i olika stadier. Mognad ökar längs den antero-bakre axeln med pelargonen vid den främre spetsen (vänster) där bakteriestamcellen bor och det äldre stadiet vid den bakre spetsen (höger). B)Z-projektion av levande äggkammare genom att snurra diskkonfokal mikroskopi i steg 6 av oogenes (vänster), där kärnan är centrerad i äggcellen. Kärnan migrerar för att anta en asymmetrisk position i steg 7 (höger) i kontakt med det främre plasmamembranet (mellan äggcellen och sjuksköterskans cell) och det laterala plasmamembranet (mellan äggcellen och follikulära cellerna). Denna position kommer att inducera bestämningen av dorsala sidan och därmed äggkammarens dorso-ventrala axel. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

I många årtionden har denna nukleära migration studerats på fasta vävnader genom immunostaining. Detta tillvägagångssätt har särskilt gjort det möjligt att visa att denna process beror på ett tätt nätverk av mikrotubuli^4,5. Mer nyligen utvecklade vi ett protokoll som erbjuder villkor som är kompatibla med live imaging av äggcellen under flera timmar vilket gör det möjligt att studera denna process dynamiskt⁶.

Därför har vi för första gången kunnat beskriva att kärnan har förmånliga och karakteristiska banor under sin migration, en längs det främre plasmamembranet (APM) och en annan längs äggcellens laterala plasmamembran (LPM) i äggcellen (figur 2). Dessa senaste resultat understryker vikten av live-imaging protokoll när man studerar dynamiska processer såsom kärnmigration.

Figur 2: Schematisk representation av kärnans olika migreringsbanor. I steg 6 av oogenesen är oocyten en stor cell med en central kärna. I detta skede ställs den antero-bakre polaritetsaxeln in med ett bakre/laterala plasmamembran av oocytet i kontakt med follikulära celler och det främre plasmamembranet (i gult) är i kontakt med sjuksköterskans celler². Vi har tidigare rapporterat att kärnan kan migrera antingen längs det främre plasmamembranet (APM), längs det laterala plasmamembranet (LPM), eller genom cytoplasman (STAD, direkt till antero-dorsala cortex)⁶. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Oocytkärnan migration är ett fenomen på ca 3 h⁶, och hittills är händelsen som utlöser början av den faktiska migreringen okänd. Starten av migreringen kan också försenas av proteinmutanter som används för att studera denna mekanism. Dessa okända variabler motiverade oss att förvärva bilder under långa tidsperioder (10-12 h). Det är därför viktigt att se till att äggcellerna förblir vid liv. När äggkammaren utvecklas sträcker den sig längs den antero-bakre axeln från en sfärisk till en elliptisk form. Denna förlängning drivs av rotationen av follikulära celler, som uppstår från steg 1 till steg 8, vinkelrätt mot antero-bakre axeln⁷. Dessutom omger en rörformig muskelstel med pulsatil egenskap äggkamrarna. Dess fysiologiska funktion är att driva de utvecklande folliklarna mot ovidukten kontinuerligt⁸. För att begränsa de rörelser som inducerar svängningar i äggkamrarna efter deras dissekering konstruerade vi en observationsmikrokammare som mäter 150 μm i höjd (figur 3A). Denna höjd är marginellt högre än storleken på en follikel i steg 10 och 11. Det begränsar avsevärt provets vertikala rörelser samtidigt som äggkammarens rotation bevaras, vilket resulterar i begränsade defekter i follikelutvecklingen. Vi utför sedan live imaging i 12 h på dissekerade äggkammare genom flerpositions timelapse förvärv med hjälp av en spinning-disk confocal mikroskop. Här beskriver vi vårt protokoll för att studera oocyt nukleär migration mellan steg 6 och 7.

Figur 3:Schematisk representation av observationskammaren. (A) (Överst) Exakta dimensioner på aluminiumrutschbanan med höjderna (A’) och omkretsarna (A”) på brunnen som borras i mitten av bilden. (B) (Nederkant) Ett täckglas som blockerar brunnen förseglas till diabilden med silikonfett. (C) (Top view) Dissekerade ovarioler utvecklas i ett bildmedium som täcks av ett gaspermeabelt membran. Halokarbonolja används för att stabilisera membranet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

För att följa nukleär migration och exakt bedöma banor i äggcellen behövs markörer för både kärnhöljet och plasmamembranet. Med detta syfte har två transgener som har ett högt signal-/brusförhållande och inte bleknar under loppet av live-avbildning valts. För att märka plasmamembranet rekommenderas användning av en P[ubi-PH-RFP] som kodar pleckstrin Homology (PH) domänen för humanfosfolipas C ∂1 (PLC∂1) som smälts till RFP. Denna PH-domän binder till fosfoinositide PI(4,5)P2 fördelad längs plasmamembranet i äggcellen⁹. För kärnhöljet visar P[PPT-un1]Fs(2)Ket-GFP proteinfälla stam där GFP sätts in i genen kodning Drosophila ß-importin en homogen och intensiv signal¹⁰. Unga flugor (1-2 dagar gamla) placeras i färska injektionsflaskar som innehåller torr jäst 24-48 h före äggstocksdesektion.

För denna levande avbildningsanalys har en 1 mm tjock bit aluminium, som inte är reaktiv för provet, skurits i dimensionerna av en mikroskopibild. Den har ett hål med diametern 16 mm i mitten av diabilden som har kontraborerats till 0,85 mm. Denna räknare har ytterligare ett hål med diametern 6 mm med ett djup på 150 μm (figur 3A). Ett täckglas limmas med silikonfett (inert för provet) längst ner i aluminiumkammaren (Figur 3B). Efter att proverna placerats i den medelfyllda brunnen placeras ett_membransom är genomsläppligt till O 2 /CO_2-utbytet över mediet och omges av halokarbonolja (figur 3C).

För dissekeringen rekommenderas att använda rostfria tångar med en spetsdimension på 0,05 x 0,02 mm och nålar med diametern 0,20 mm för separation av ovariolerna(figur 4B,C). De migrerande kärnorna avbildas på ett konvertiskt inverterat mikroskop med spinnskiva som är utrustat med en kamera. Flerpositionsbilder förvärvades genom timelapse var 15: e minut vid 24 °C. Ett intervall på 15 minuter gör det möjligt att utföra flerpositionsförvärv med begränsad fotoblekning av fluorescerande proteiner och fototoxicitet för proverna. Dessutom skulle ett kortare intervall inte ge mycket mer informativa uppgifter för att följa kärnkraftsbanorna. Filmerna bearbetas och analyseras via Fiji programvara¹¹.

Protocol

1. Förberedelse av bildmedium Förbered nya medier på användningsdagen. Pipett 200 μL Schneider medium (innehållande L-glutamin och 0,40 g/L NaHCO3 kompletterad med 10% värmeinaktiverat fosterkalvserum, 100 U/ml penicillin och 100 mg/ml streptomycin). Tillägg med 30 μL insulin 10 mg/ml. Tillsätt 4 μL värmeinaktiverat fosterkalvserum. 2. Förberedelse av observationskammare Applicera en liten mängd silikonfett runt hålet på …

Representative Results

Före migreringen är kärnan dynamisk och svänger runt en central position under en period som definieras som förmigrering. Dessa små rörelser återspeglar en balans mellan att trycka och dra krafter som upprätthåller jämvikt i mitten av äggcellen. Genom att kvantifiera kärnornas banor har vi visat att APM- och LPM-banorna hade liknande proportioner. Vi definierar banans natur genom den första kontakten mellan kärnan och plasmamembranet6. Således når kärnan antingen APM eller LPM in…

Discussion

Andra protokoll beskriver hur man förbereder och odlar Drosophila äggkammare ex vivo för live-imaging assay^12,13. Nyheten med detta protokoll är användningen av en bildkammare konstruerad med hjälp av en ihålig aluminiumrutschbana, ett täckglas och ett O₂/ CO₂ genomsläppligt membran. Den största fördelen med denna uppsättning är att begränsa rörelsen i Z utan att utöva tryck på provet. Således kan äggcellen fortfa…

Materials

Anesthetize CO2 pad	Dutscher	789060	Anesthetize flies
Coverslip (24×50 mm)	Knittel Glass	VD12450Y100A	Observation-chamber preparation
Forceps Dumont #5	Carl Roth	K342.1	Dissection
Stainless steel needles	Entosphinx	20	Dissection
Heat-inactivated fetal calf serum	SIGMA-ALDRICH	F7524	Imaging medium
Insulin solution bovine pancreas	SIGMA-ALDRICH	10516 – 5ml	Imaging medium
Penicilin/Streptomycin solution	SIGMA-ALDRICH	P0781	Imaging medium
Permeable membrane	Leica	11521746	Observation-chamber preparation
Schneider Medium	Pan Biotech	P04-91500	Imaging medium
Silicon grease	BECKMAN COULTER	335148	Observation-chamber preparation
Spinning disk confocal	Zeiss	CSU-X1	Nuclear migration observation
Voltalef oil 10S	VWR	24627 – 188	Observation-chamber preparation