Propagation de cellules et d’organes dentaires et respiratoires en microgravité

Summary

Ce protocole présente une méthode pour la culture et la croissance 3D de cellules de type améloblaste en microgravité afin de maintenir leur forme allongée et polarisée ainsi que l’expression protéique spécifique de l’émail. Les conditions de culture pour la culture de constructions d’ingénierie parodontale et d’organes pulmonaires en microgravité sont également décrites.

Abstract

La gravité est l’un des principaux déterminants de la fonction cellulaire humaine, de la prolifération, de l’architecture et de l’orientation du cytosquelette. Les systèmes de bioréacteurs rotatifs (RCCS) imitent la perte de gravité telle qu’elle se produit dans l’espace et fournissent plutôt un environnement de microgravité grâce à une rotation continue de cellules ou de tissus en culture. Ces RCCS assurent un approvisionnement ininterrompu en nutriments, en facteurs de croissance et de transcription et en oxygène, et corrigent certaines des lacunes des forces gravitationnelles dans les boîtes de culture cellulaire ou d’organe 2D immobiles (bidimensionnelles). Dans la présente étude, nous avons utilisé des RCCS pour co-cultiver des cellules de l’anse cervicale et des cellules de pulpe dentaire pour devenir des améloblastes, pour caractériser les interactions progéniteur parodontal/échafaudage et pour déterminer l’effet de l’inflammation sur les alvéoles pulmonaires. Les environnements RCCS ont facilité la croissance de cellules de type améloblaste, favorisé la prolifération des progéniteurs parodontaux en réponse aux revêtements d’échafaudage et permis d’évaluer les effets des changements inflammatoires sur les alvéoles pulmonaires en culture. Ce manuscrit résume les conditions environnementales, les matériaux et les étapes du processus et met en évidence les aspects critiques et les détails expérimentaux. En conclusion, les RCCS sont des outils innovants pour maîtriser la culture et la croissance 3D (tridimensionnelle) de cellules in vitro et pour permettre l’étude de systèmes cellulaires ou d’interactions non adaptés aux environnements de culture 2D classiques.

Introduction

La gravité affecte tous les aspects de la vie sur Terre, y compris la biologie des cellules individuelles et leur fonction au sein des organismes. Les cellules détectent la gravité à travers les mécanorécepteurs et réagissent aux changements de gravité en reconfigurant les architectures du cytosquelette et en modifiant la division cellulaire ^1,2,3. D’autres effets de la microgravité comprennent la pression hydrostatique dans les vésicules remplies de liquide, la sédimentation des organites et la convection du flux et de la chaleur^induite par la flottabilité 4. Des études sur l’effet de la perte de gravité sur les cellules et les organes humains ont été menées à l’origine pour simuler l’environnement en apesanteur de l’espace sur les astronautes lors de missions de vol spatial⁵. Cependant, ces dernières années, ces technologies de bioréacteurs 3D développées à l’origine par la NASA pour simuler la microgravité sont devenues de plus en plus pertinentes en tant que nouvelles approches pour la culture de populations cellulaires qui ne se prêtent pas autrement aux systèmes de culture 2D.

Les bioréacteurs 3D simulent la microgravité en cultivant des cellules en suspension et créent ainsi un effet de « chute libre » constant. Parmi les autres avantages des bioréacteurs rotatifs, citons l’absence d’exposition à l’air rencontrée dans les systèmes de culture d’organes, une réduction de la contrainte de cisaillement et de la turbulence, et une exposition continue à un approvisionnement changeant en nutriments. Ces conditions dynamiques fournies par un bioréacteur RCCS (Rotary Cell Culture System) favorisent la colocalisation spatiale et l’assemblage tridimensionnel de cellules individuelles en agrégats ^6,7.

Des études antérieures ont démontré les avantages d’un bioréacteur rotatif pour la régénération osseuse⁸, la culture de germes dentaires⁹ et pour la culture de cellules folliculaires dentaires humaines¹⁰. Il y a également eu un rapport suggérant que le RCCS améliore la prolifération et la différenciation des cellules EOE en améloblastes¹¹. Cependant, les cellules différenciées ont été considérées comme des améloblastes en fonction de l’immunofluorescence de l’améloblastine et/ou de l’expression de l’amélogénine seule¹¹ sans tenir compte de leur morphologie allongée ou de la forme polarisée des cellules.

En plus du bioréacteur RWV (rotating wall vessel) développé par la NASA, d’autres technologies permettant de générer des agrégats 3D à partir de cellules comprennent la lévitation magnétique, la machine de positionnement aléatoire (RPM) et le clinostat¹². Pour obtenir une lévitation magnétique, les cellules marquées avec des nanoparticules magnétiques sont en lévitation à l’aide d’une force magnétique externe, ce qui entraîne la formation de structures 3D sans échafaudage qui ont été utilisées pour la biofabrication de structures adipocytaires^13,14,15. Une autre approche pour simuler la microgravité est la génération de forces G multidirectionnelles en contrôlant la rotation simultanée autour de deux axes, ce qui entraîne une annulation du vecteur de gravité cumulé au centre d’un dispositif appelé clinostat¹⁶. Lorsque des cellules souches de moelle osseuse ont été cultivées dans un clinostat, la formation de nouveaux os a été inhibée par la suppression de la différenciation des ostéoblastes, illustrant l’un des effets dédifférenciateurs de la microgravité¹⁶.

Les systèmes in vitro visant à faciliter la culture fidèle des améloblastes constitueraient un grand pas en avant vers l’ingénierie tissulaire de l’émail^{dentaire 17}. Malheureusement, à ce jour, la culture des améloblastes a été une entreprise difficile^18,19. Jusqu’à présent, cinq lignées cellulaires différentes de type améloblaste ont été signalées, y compris la lignée cellulaire améloblaste de souris (ALC), la lignée cellulaire épithéliale dentaire de rat (HAT-7), la lignée cellulaire LS8 de souris²⁰, la lignée cellulaire porcine PABSo-E 21 et la lignée cellulaire SF2-24 de rat²². Cependant, la majorité de ces cellules ont perdu leur forme cellulaire polarisée distinctive en culture 2D.

Dans la présente étude, nous nous sommes tournés vers un système de bioréacteur de culture cellulaire rotative (RCCS) pour faciliter la croissance de cellules de type améloblaste à partir d’épithéliums de l’anse cervicale co-cultivées avec des progéniteurs mésenchymateux et pour surmonter les défis des systèmes de culture 2D, y compris la réduction du flux de nutriments et les changements cytosquelettiques dus à la gravité. De plus, le RCCS a fourni de nouvelles avenues pour l’étude des interactions cellule/échafaudage liées à l’ingénierie des tissus parodontaux et pour examiner les effets des médiateurs inflammatoires sur les tissus alvéolaires pulmonaires in vitro. Ensemble, les résultats de ces études mettent en évidence les avantages des systèmes de culture rotatoire basés sur la microgravité pour la propagation de l’épithélium différencié et pour l’évaluation des effets environnementaux sur les cellules cultivées in vitro, y compris les interactions cellule/échafaudage et la réponse tissulaire aux conditions inflammatoires.

Protocol

Toutes les approbations institutionnelles nécessaires ont été obtenues pour s’assurer que l’étude était conforme aux lignes directrices institutionnelles de TAMU en matière de soins aux animaux. 1. Assemblage et stérilisation du bioréacteur Stériliser quatre récipients à rapport d’aspect élevé (HARV) pour le bioréacteur dans un autoclave sur le cycle d’instrument en plastique pendant 20 minutes à 121 ° C comme recommandé par le fabricant. Après st?…

Representative Results

La chambre intérieure du bioréacteur fournit un environnement permettant aux cellules de proliférer et de se différencier, de s’attacher à un échafaudage ou de se rassembler pour former des assemblages tissulaires. Chaque vaisseau HARV contient jusqu’à 10 ml de milieu et facilite une circulation constante des nutriments afin que chaque cellule ait une excellente chance de survivre. La figure 1A illustre la fixation des orifices de seringue à la plaque avant du récipient où sont…

Discussion

Les étapes critiques du protocole pour la croissance des cellules en microgravité comprennent le bioréacteur, l’échafaudage, les cellules utilisées pour la culture 3D et le revêtement d’échafaudage comme moyen d’induire la différenciation cellulaire. Le type de bioréacteur utilisé dans nos études comprend le bioréacteur RCCS-4, une modification récente du dispositif de culture tissulaire cylindrique rotatif original Rotary Cell Culture System (RCCS) développé par la NASA pour cultiver des cellules en…

Materials

Antibiotic-antimycotic	ThermoFisher Scientfic	15240096
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A4544
BGJb Fitton-Jackson Modification media	ThermoFisher Scientfic	12591
BIOST PGA scaffold	Synthecon	Custom	Available from the company through a custom order
BMP-2	R&D Systems	355-BM
BMP-4	R&D Systems	314-BP
DMEM Media	Sigma Aldrich	D6429-500mL
FBS	ThermoFisher Scientfic	16140071
Fibricol	Advanced Biomatrix	5133-20mL
Fibronectin	Corning	354008
Galanin	Sigma Aldrich	G-0278
Gelatin disc	Advanced Biomatrix	CytoForm 500
Graphene sheets	Advanced Biomatrix	CytoForm 300
hEGF	Peprotech	AF-100-15
hFGF	ThermoFisher Scientfic	AA1-155
Hydroxyapatite disc	Advanced Biomatrix	CytoForm 200
Il-6 protein	PeproTech	200-06
Keratinocyte SFM media (1X)	ThermoFisher Scientfic	17005042
Laminin	Corning	354259
LRAP peptide	Peptide 2.0	Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD
Matrigel	Corning	354234
Millipore Nitrocellulose membrane	Merck Millipore	AABP04700
RCCS Bioreactor	Synthecon	RCCS 4HD
SpongeCol	Advanced Biomatrix	5135-25EA
Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock	Smiths Medical	MX5-61L
Syringes with needle 3cc	McKESSON	16-SN3C211
Trypsin EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientfic	25200056