Summary
Здесь описаны подробные пошаговые протоколы изучения механических сигналов in vitro с использованием мультипотентных клеток нервного гребня O9-1 и полиакриламидных гидрогелей различной жесткости.
Abstract
Клетки нервного гребня (NCC) представляют собой эмбриональные мультипотентные клетки позвоночных, которые могут мигрировать и дифференцироваться в широкий спектр типов клеток, которые дают начало различным органам и тканям. Жесткость тканей производит механическую силу, физический сигнал, который играет решающую роль в дифференцировке NCC; однако механизм остается неясным. Способ, описанный здесь, предоставляет подробную информацию для оптимизированной генерации полиакриламидных гидрогелей различной жесткости, точного измерения такой жесткости и оценки воздействия механических сигналов в клетках O9-1, линии NCC, которая имитирует NCC in vivo NCC.
Жесткость гидрогеля измеряли с помощью атомно-силовой микроскопии (AFM) и соответственно указывали на различные уровни жесткости. O9-1 NCC, культивируемые на гидрогелях различной жесткости, показали различную морфологию клеток и экспрессию генов стрессовых волокон, что указывало на различные биологические эффекты, вызванные изменениями механического сигнала. Кроме того, было установлено, что изменение жесткости гидрогеля привело к созданию эффективной системы in vitro для манипулирования механической сигнализацией путем изменения жесткости геля и анализа молекулярно-генетической регуляции в NCC. NCC O9-1 могут дифференцироваться в широкий спектр типов клеток под воздействием соответствующих дифференцирующих сред, и удобно манипулировать химическими сигналами in vitro. Таким образом, эта система in vitro является мощным инструментом для изучения роли механической сигнализации в NCC и ее взаимодействия с химическими сигналами, что поможет исследователям лучше понять молекулярно-генетические механизмы развития нервного гребня и заболеваний.
Introduction
Клетки нервных гребней (NCC) представляют собой группу стволовых клеток во время эмбриогенеза позвоночных с замечательной способностью мигрировать и способствовать развитию различных органов и тканей. NCC могут дифференцироваться в различные типы клеток, включая сенсорные нейроны, хрящи, кости, меланоциты и гладкомышечные клетки, в зависимости от местоположения осевого происхождения и местного экологического руководства NCC1,2. Обладая способностью дифференцироваться в широкий спектр типов клеток, генетические аномалии, вызывающие дисрегуляцию на любой стадии развития нервного гребня (НК), могут привести к многочисленным врожденным заболеваниям2. Например, возмущения во время формирования, миграции и развития NCC приводят к нарушениям развития, известным в совокупности как нейрокристопатии1,3. Эти заболевания варьируются от черепно-лицевых дефектов из-за сбоя в образовании NCC, таких как синдром Тричера Коллинза, до развития различных видов рака из-за метастатической мигрирующей способности NCC, как видно при меланоме3,4,5,6. За последние несколько десятилетий исследователи сделали замечательные открытия о роли и механизмах NCC в развитии и заболеваниях, причем большинство результатов сосредоточены на химических сигналах7,8. Совсем недавно было указано, что механические сигналы играют решающую, но плохо понятную роль в разработке NCC9,10.
Экологические сигналы NCC играют решающую роль во время их развития, включая регулирование дифференцировки NCC в различные типы клеток. Сигналы окружающей среды, например, физические сигналы, влияют на ключевое поведение и клеточные реакции, такие как функциональная диверсификация. Механотрансдукция позволяет клеткам ощущать и реагировать на эти сигналы для поддержания различных биологических процессов2. NCC окружены соседними клетками и различными субстратами, такими как внеклеточный матрикс (ECM), который может давать начало механическим стимулам для поддержания гомеостаза и адаптации к изменениям посредством определения судьбы, пролиферации и апоптоза11. Механотрансдукция начинается на плазматической мембране, где происходит сенсорный компонент механических внеклеточных раздражителей, в результате чего происходит внутриклеточная регуляция клетки12. Интегрины, фокальные спайки и соединения плазматической мембраны ретранслируют механические сигналы, такие как силы сдвига, напряжение и жесткость окружающих субстратов, в химические сигналы для получения клеточных реакций12. Ретрансляция химических сигналов от плазматической мембраны к конечной клеточной регуляции осуществляется через различные сигнальные пути для завершения жизненно важных для организма процессов, таких как дифференцировка.
Несколько исследований показали, что механическая сигнализация от жесткости субстрата играет роль в дифференцировке клеток13,14. Например, предыдущие исследования показали, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК), выращенные на мягких субстратах с жесткостью, аналогичной жесткости ткани мозга (в диапазоне 0,1-1,0 кПа), приводили к дифференцировке нейрональных клеток15,16. Однако больше МСК дифференцируются в миоцитоподобные клетки при выращивании на субстратах 8-17 кПа, имитирующих жесткость мышц, в то время как остеобластная дифференцировка наблюдалась при культивировании МСК на жестких субстратах (25-40 кПа)15,16. Значение механотрансдукции подчеркивается нарушениями и аномалиями в механическом сигнальном пути, которые потенциально приводят к тяжелым дефектам развития и заболеваниям, включая рак, сердечно-сосудистые заболевания и остеопороз17,18,19. При раке нормальная ткань молочной железы мягкая, и риск рака молочной железы увеличивается в жесткой и плотной ткани молочной железы, среда, которая больше похожа на опухоли молочной железы15. Обладая этими знаниями, влияние механической сигнализации на развитие NCC может быть изучено путем простого манипулирования жесткостью субстрата через систему in vitro, обеспечивая дополнительные преимущества и возможности в понимании основ прогрессирования и этиологии заболеваний, связанных с NC.
Для изучения влияния механических сигналов в НКЦ создана эффективная система in vitro для ННК, основанная на оптимизации ранее опубликованных методов и оценке реакций НКЦ на различные механические сигналы20,21. Был разработан подробный протокол для получения различной жесткости гидрогеля и оценки воздействия механической сигнализации в НКЦ. Для достижения этой цели NCC O9-1 используются в качестве модели NC для изучения эффектов и изменений в ответ на жесткие и мягкие гидрогели. O9-1 NCC представляют собой стабильную клеточную линию NC, выделенную из эмбриона мыши (E) в день 8,5. O9-1 NCC имитируют NCC in vivo, потому что они могут дифференцироваться в различные типы клеток, полученных из NC, в определенных дифференцировочных средах22. Для изучения механической сигнализации ННК изготавливали матричную подложку с перестраиваемой эластичностью из изменяющихся концентраций растворов акриламида и бис-акриламида для достижения желаемой жесткости, коррелирующей с жесткостью биологического субстрата20,21,23. Для оптимизации условий матричной субстрата для NCC, в частности O9-1 клеток, были сделаны модификации из ранее опубликованного протокола20. Одно из изменений, внесенных в этот протокол, заключалось в инкубации гидрогелей в коллагене I, разбавленном в 0,2% уксусной кислоты вместо 50 мМ HEPES, при 37 °C в течение ночи. Низкий рН уксусной кислоты приводит к однородному распределению и более высокому включению коллагена I, что позволяет более равномерно присоединять белок ECM24. Кроме того, комбинацию конской сыворотки и фетальной бычьей сыворотки (FBS) использовали в концентрациях 10% и 5% в фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS) соответственно перед хранением гидрогелей в инкубаторе. Конская сыворотка использовалась в качестве дополнительной добавки к FBS из-за ее способности способствовать пролиферации и дифференцировке клеток в концентрации 10%25.
С помощью этого метода биологическая среда была имитирована белковым покрытием ECM (например, коллагеном I), чтобы создать точную среду in vitro для NCC, чтобы расти и выживать20,21. Жесткость подготовленных гидрогелей была количественно проанализирована с помощью атомно-силовой микроскопии (AFM), хорошо известного метода для изображения модуля упругости26. Чтобы изучить влияние различных уровней жесткости на NCC, клетки дикого типа O9-1 культивировали и готовили на гидрогелях для окрашивания иммунофлуоресценцией (IF) против нитевидного актина (F-актина), чтобы показать различия в адгезии и морфологии клеток в ответ на изменения жесткости субстрата. Используя эту систему in vitro, исследователи смогут изучить роль механической сигнализации в NCC и ее взаимодействие с другими химическими сигналами, чтобы получить более глубокое понимание взаимосвязи между NCC и механической сигнализацией.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение гидрогеля
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы должны быть выполнены в вытяжке для культивирования клеток, которая была продезинфицирована этанолом и ультрафиолетовым (УФ)-стерилизованным перед использованием для поддержания стерильности. Инструменты, такие как пинцет и пипетки, должны быть опрысканы этанолом. Буферные растворы также должны быть стерильно-фильтрованы.
- Приготовление стеклянных обложек с аминосилановым покрытием
- Поместите нужное количество стеклянных крышек на кусок лабораторной салфетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте дополнительные 3-4 крышки, чтобы обеспечить достаточные резервные запасы, так как они легко ломаются. Различные материалы стеклянных покровных пластинок дадут разную совместимость посева и крепления клеток. Лучше определить, какой тип лучше всего подходит для эксперимента, прежде чем начинать эксперименты (см. Таблицу материалов). - Используйте спиртовую горелку или горелку Бунзена, чтобы стерилизовать каждый покров, пропуская его вперед и назад через пламя (30 с для экспериментов по анализу белка). Поместите каждую стеклянную крышку на лабораторную салфетку, чтобы она остыла.
- Как только стеклянные крышки остынут, переложите их на чашку Петри, выстланную парапленкой, чтобы предотвратить проскальзывание.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если крышки недостаточно холодные, остаточное тепло расплавит парапленку на скольжениях, что сделает их непригодными для использования. - Накройте крышки примерно 200 мкл и 800 мкл 0,1 М NaOH на 12 мм и 25 мм крышки соответственно и дайте им постоять в течение 5 минут. Затем аспирируйте 0,1 М NaOH и дайте обшивкам высохнуть на воздухе еще 5 минут, чтобы сформировать ровную пленку.
- После того, как крышки высушены, пипетка приблизительно 80 мкл и 150 мкл 3-аминопропилтриэтоксисилана (APTS) на 12 мм и 25 мм покрывает крышки соответственно. Будьте осторожны, чтобы не пролить раствор на парапленку. Дайте раствору постоять 5 мин.
- Аспирируйте как можно больше избытка APTS и дайте остаточному APTS высохнуть в течение 5 минут. Хорошо промойте крышки, погружая их в стерильные, деионизированные (DI) H2Oтри раза в течение 5 мин каждый раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если стеклянные крышки плохо промыты, остаточный APTS вызывает нежелательные реакции с глутаровым альдегидом, вызывая образование белого осадка и приводя к непригодным для использования покровам. - Переместите крышки на новую чашку Петри реактивной стороной вверх. Добавьте достаточное количество 0,5% глутарового альдегида в чашку Петри, чтобы полностью покрыть крышки и дать обшивкам постоять в течение 30 минут.
- Аспирировать 0,5% глутаральдегида и снова промыть крышки в DIH2Oодин раз в течение 3 мин. Установите реактивную сторону крышки на лабораторную салфетку или чистую чашку Петри, чтобы она полностью высохла на воздухе перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол может быть приостановлен; крышки должны быть помещены в стерильный DI H2Oдо использования.
- Поместите нужное количество стеклянных крышек на кусок лабораторной салфетки.
- Приготовление силиконизированных обшивок
- Поместите такое же количество обложек, как и покрытые аминосиланом чехлы (этап 1.1.1), в чашку Петри, выстланную парапленкой.
- Пипетка 40 мкл или 150 мкл на 12 мм и 25 мм обшивка соответственно дихлорметилсилана (DCMS) с одной стороны крышки и позволяет раствору постоять в течение 5 мин.
- Аспирировать любой оставшийся раствор из крышки, промыть стерильным DIH2Oодин раз в течение 1 мин и поместить реактивные покровы лицевой стороной вверх на лабораторную салфетку до полного высыхания на воздухе, прежде чем перейти к следующему этапу.
- Приготовление гидрогелей
- Смешайте акриламид, бис-акриламид и DIH2Oв центрифужной трубке объемом 1,5 мл для получения 500 мкл растворов с различной жесткостью (см. таблицу 1). Вихрь раствора в течение 30 с тщательно перемешать.
- Работая быстро, добавьте 10% раствор персульфата аммония (APS) и тетраметилэтилендиамин (TEMED) в трубку и снова вихрьте растворы для смешивания растворов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте свежий 10% APS и оставьте его на льду или заморозьте в одноразовые аликвоты из-за его чувствительного цикла замораживания / оттаивания. - Пипетку приблизительно 33 мкл или 100 мкл раствора на высушенные 12 мм или 25 мм покрытые аминосиланом покровные листы (раздел 1.1), соответственно.
- Используя изогнутый пинцет, немедленно поместите обработанный DCMS покровный лист поверх раствора геля с обработанной стороной, касающейся раствора геля, таким образом, зажав раствор геля между обработанным DCMS чехлом и покрытым аминосиланом чехлом.
- Дайте гелевому раствору полимеризоваться в течение 5-15 мин, при этом активно контролируя полимеризацию геля оставшегося раствора в пробирке.
- После полимеризации геля отделите обработанный DCMS покровный лист изогнутым пинцетом или лезвием бритвы, оставив гель прикрепленным к исходному покрытому аминосиланом чехлу.
- Немедленно поместите крышку с прикрепленным гидрогелем в заданную 4-луночную/24-луночную и 6-луночную пластину, покрытую 500 мкл и 2 мл стерильных PBS или DI H2O на 12 мм и 25 мм обшивки соответственно, чтобы предотвратить высыхание геля.
- Повторите шаги 1.3.4-1.3.7 для всех обложек.
- Погружают гидрогели в стерильные PBS или DI H2O на 30 мин для удаления избытка раствора акриламида. Храните гидрогели в стерильном PBS или DI H2O при 4 °C для процедурной остановки здесь.
- В темном помещении готовят смесь сульфосуцинимидила 6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноата (сульфо-SANPAH) путем смешивания 2,5 мл 50 мМ 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этанесульфоновой кислоты (HEPES) (pH=8,5) с 25 мкл 50 мкг/мл сульфо-САНПАГ в конической трубке, обернутой в алюминиевую фольгу для защиты от света. Используйте пипетку, чтобы хорошо перемешать раствор перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объема 2,5 мл раствора сульфо-САНПАГ достаточно примерно для двадцати пяти 12-мм гидрогелей или пяти 25-мм гидрогелей. - Аспират PBS или DI H2O из плиты скважины. Добавьте приблизительно 100 мкл или 500 мкл на 12 мм и 25 мм обшивки, соответственно, раствора сульфо-SANPAH (стадия 1.3.10) для покрытия геля. Убедитесь, что раствор полностью покрывает гель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте силу вакуумного всасывания, чтобы предотвратить разрыв или нарушение гидрогелей сильного взаимодействия. - Поместите гели с раствором под ультрафиолетовый свет 15 Вт, 365 нм в течение 10 мин, чтобы свести к минимуму любые помехи УФ-света, реагирующего с сульфо-SANPAH.
- Аспирируйте избыток сульфо-SANPAH, наклоняя пластину, чтобы собрать как можно больше раствора. Промыть гель с 50 мМ HEPES два-три раза.
- Добавьте 500 мкл и 2 мл на 12 мм и 25 мм гелей, соответственно, из 50 мг/мл коллагена I, разбавленного в 0,2% уксусной кислоты, в каждую скважину, содержащую гидрогель. Дайте гелям инкубироваться в течение ночи в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавьте коллаген I в 0,2% уксусной кислоты вместо 50 мМ HEPES для содействия однородному распределению и прикреплению коллагена I. - Аспирировать коллаген I и промыть гели стерильным PBS три раза, чтобы удалить избыток коллагена I в течение 5 мин каждую стирку. Инкубируют гидрогели в PBS с 10% конской сывороткой, 5% FBS в течение 2 ч в инкубаторе 37 °C, 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление 10% конской сыворотки способствует более высокой пролиферации по сравнению с использованием только FBS, как это было сделано в предыдущей публикации. - Аспирировать среду. Добавьте 500 мл стерильно-фильтрованной модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицином (P / S) в каждую лунку. Храните гели в инкубаторе 37 °C, 5% CO2 до готовности к культивированию клеток.
- После готовности пластину примерно 1,5 × 104 O9-1 клеток/см2 в базальной среде в культуральной посуде. Инкубируют клетки в течение 2 дней в инкубаторе при 37 °C, 5% CO2. Проверьте клетки на слияние, чтобы убедиться, что клетки достаточно прикреплены к гелям, и что количество клеток достаточно перед сбором для анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: См. ранее опубликованный протокол для этапов восстановления, прохождения и сбора клеток O9-120. - Перейдите к разделам 2, 3 или 4 для дальнейшего анализа гидрогелей.
2. Количественный анализ жесткости с помощью AFM
- Запустите системный компьютер AFM, а затем контроллер AFM (см. Таблицу материалов).
- Установите консоль AFM на держатель зонда AFM. Используйте сферический консоль с 0,5 мкм кварцевой бусины, установленной на конце кантилевера (консоль со сферической бусиной).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для более жестких гидрогелей, таких как 10 кПа, 20 кПа и 40 кПа, использовался более жесткий зонд с постоянной пружины 0,24 Н/м. Более мягкий зонд использовался для более мягких гидрогелей, таких как 0,5 кПа и 1 кПа, с постоянной пружины 0,059 Н/м. - Установите программное обеспечение AFM в режим контакта.
- Установите кремниевую пластину на стадию образца AFM для сбора кривых силы, нажав на Engage для консольного устройства, чтобы коснуться кремниевой подложки, тем самым генерируя кривые силы.
- Используйте кривые силы, приведенные выше (2.4) для калибровки, нажмите «Калибровка» в управляющем программном обеспечении, чтобы получить среднюю константу пружины консольного аппарата в условиях тепловой настройки, и сохраните калиброванные значения в управляющем программном обеспечении.
- Установите образцы, поместив крышку с прикрепленным гидрогелем в 60-миллиметровую чашку Петри на ступень сканирования AFM. Добавьте 3 мл PBS в блюдо перед проведением измерений, чтобы предотвратить высыхание геля.
- Настройте AFM на работу в контактном режиме (жидкость), чтобы начать измерение. Задействуйте сферическую бусину, чтобы непрерывно касаться и поднимать образец геля.
- Установите консоль так, чтобы ее порог отклонения оставался на уровне 10 нм. Держите размер зонда на уровне 10 мкм. Затем запишите кривые силы, как на шаге 2.4.
- Получите по меньшей мере 20 силовых кривых от по меньшей мере 3 до 10 различных пятен по всей поверхности гидрогеля.
- Рассчитайте средний модуль Юнга ~ 20 кривых силы для каждого пятна с помощью программного обеспечения для визуализации и анализа AFM. Используйте кривые силы расширения рампы и линеаризированную модель (сферическую). Рассчитайте среднее значение всех пятен для каждого образца, чтобы получить окончательную жесткость.
ПРИМЕЧАНИЕ: Модуль Юнга и связанные с ним данные(т.е. стандартные отклонения) автоматически сохраняются в виде электронной таблицы. - Повторите шаги 2.6-2.10 для всех образцов.
3. Молекулярный анализ жесткости с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания
- Используйте пинцет для транспортировки крышки на новую пластину, чтобы свести к минимуму ложные сигналы от клеток, выращенных непосредственно на пластине. Промыть клетки 500 мкл стерильного PBS три раза, чтобы удалить мертвые клетки и любую оставшуюся питательную среду.
- Зафиксируйте клетки, используя 500 мкл 4% параформальдегида (PFA) в течение 10 мин при комнатной температуре, без помех. Затем промывайте клетки три раза, используя 500 мкл PBS/лунку в течение 2 мин каждая.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить при температуре 4 °C для процедурной остановки. - Обрабатывайте клетки 500 мкл 0,1% Тритона Х-100 в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем промыть клетки три раза 500 мкл PBS/well.
- Блокируйте клетки 250 мкл 10% ослиной сыворотки (разведенной в PBS и 0,1% Tween 20) на лунку в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Инкубируют клетки с 250 мкл первичных антител в течение 2 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 °C. Затем промыть клетки три раза 500 мкл PBS/лунку в течение 5 мин каждая.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анти-Винкулин (Vcl) (1:250) и анти-AP2 альфа (1:250) были использованы в этом эксперименте и были разведены в 10% ослиной сыворотке. - Инкубируют клетки с соответствующими вторичными антителами и/или фаллоидином, используемыми для окрашивания F-актином, в разведении 1:400 в 250 мкл 10% ослиной сыворотки в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем промыть клетки три раза PBS в течение 5 минут каждая.
ПРИМЕЧАНИЕ: 568 нм фаллоидин может быть совместно инкубирован с 488 нм или 647 нм вторичными антителами или самостоятельно. - Инкубируют клетки с 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI, разведение 1:1000) в 250 мкл PBS в течение 10 мин с последующей последней промывкой PBS в течение 2 мин.
- Добавьте в каждую лунку 3-4 капли монтажной среды. Храните образцы при температуре 4 °C, чтобы установить их в течение не менее 2 ч перед визуализацией, чтобы убедиться, что монтажная среда установлена правильно.
- Захват изображений по меньшей мере 3 случайных кадров на образец гидрогеля с помощью флуоресцентного микроскопа, производя отдельные и объединенные каналы.
4. Количественная ПЦР в реальном времени (ОТ-qPCR)
- Перенесите гидрогели с адгезивными клетками для сбора РНК на новую пластину, чтобы свести к минимуму нежелательные РНК от клеток, прикрепленных к клеточной пластине. Промыть клетки PBS три раза, чтобы удалить мертвые клетки и культуральную среду.
- Извлеките общую мРНК с помощью набора для экстракции РНК. Выполняют обратную транскрипцию РНК в кДНК с помощью супермикса обратной транскрипции в соответствии с инструкциями производителя.
- Выполняют RT-qPCR с грунтовками для Vcl в качестве маркера жесткости выбора и анализируют с использованием метода 2-ΔΔCT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буквенная последовательность Vcl: Вперед 5' GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; реверс 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Получение гидрогеля и оценка жесткости с помощью ОВМ и модели Герца
Здесь приведен подробный протокол получения полиакриламидных гидрогелей различной жесткости путем регулирования соотношения акриламида и бис-акриламида. Однако полиакриламидные гидрогели не готовы к адгезии клеток из-за отсутствия белков ECM. Таким образом, сульфо-SANPAH, действуя как линкер, ковалентно связывается с гидрогелями и реагирует с первичными аминами белков ECM, обеспечивая адгезию белков ECM к поверхностям гидрогелей через N-гидроксисукцинимидный эфир в сульфо-SANPAH после УФ-активации. Коллаген типа I использовался в качестве белка ECM для эффективного содействия прикреплению клеток O9-1. Для обеспечения точных значений жесткости различных гидрогелей была проведена оценка жесткости с использованием AFM, хорошо известного метода изображения модуля упругости.
При успешном образовании и прикреплении полиакриламидного гидрогеля к стеклянному покровному слипу гель оставался прилипшим к покровному листу с ровной поверхностью и минимальным разрывом. Жесткость измеряли методом AFM на основе метода инденции, в котором к образцу прикладывали жесткий индентер с требуемой силой для достижения глубины отступа26. С помощью этого измерения модуль упругости Юнга был рассчитан на основе углубления глубины и силы в модели Герца, теории упругости26. Однако из-за большой вариации результатов по АСМ был применен дополнительный статистический метод для получения количественного результата с минимальным воздействием неровных поверхностей и несовершенной однородностью растворовгеля 26. Для получения количественного измерения с использованием AFM была взята компиляция по меньшей мере 50 кривых силы и расстояния от каждого места на образце геля для средней жесткости образца. Сила, приложенная к гелю высокой жесткости, была выше, чем к более мягкому гелю, что указывает на то, что более жесткая подложка дала более крутой наклон на графике Force vs. Z, в котором сила измеряется в nN, а Z указывает глубину отступа между индентером и образцом.
На мягких гидрогелях наклон кривой генерируемой силы был мягким, так как требуемая сила от зонда AFM была меньше(рисунок 1A). Однако на жестких гидрогелях, таких как гидрогели с модулем 40 кПа, образовавшийся наклон был намного круче, поскольку приложенная сила была выше, чем для более мягких гелей(рисунок 1B). По мере уменьшения расстояния между зондом и образцом гидрогеля кривая значительно увеличивается по мере того, как кончик зонда касается стеклянной крышки. Однако, когда расстояние разделения увеличивается, кривая просто приближается к 0, поскольку нет приложенной силы.
Как показано на рисунке 1A,консоль на зонде AFM приблизилась к гелю, обозначенному синей линией, и зонд измерил приложенную силу, необходимую для проникновения в образец геля и в конечном итоге достиг стеклянного покрова, вызывая внезапное увеличение силы. Из-за возможных процедурных и инструментальных ошибок, таких как качество требуемых растворов, истинная жесткость образцов гидрогеля варьируется в значительной степени и далека от желаемой жесткости. Таким образом, AFM является полезным инструментом для проверки и подтверждения методологии, предотвращая ложное представление данных в дальнейших экспериментах.
В этой оценке AFM пять подготовленных образцов гидрогеля были измерены с помощью количественного подхода. Протокол был сосредоточен на уровнях жесткости гидрогеля 0,5 кПа, 1 кПа, 10 кПа, 20 кПа и 40 кПа, которые имитируют широту уровней жесткости биологического субстрата, сообщаемых для дифференцировки различных типов клеток. Силовые кривые, полученные из измерений AFM, были использованы для генерации модуля упругости Юнга в килопаскалих с использованием программного обеспечения алгоритма анализа AFM(рисунок 2).
Сравнение полиакриламидных гидрогелевых систем и типов клеток
Эта адаптация оригинального протокола Це и его коллегами обеспечивает эффективный и действенный подход к изучению механочувствительных аспектов NCC с использованием клеток O9-120. Модификации предыдущего протокола включают модификацию инкубации белка ECM: замену 50 мМ HEPES 0,2% уксусной кислотой и добавление 10% конской сыворотки и FBS для клеточной культуры (этап 1.3.14-1.3.15). Эти модификации были подтверждены путем сравнения роста и поддержания NCC O9-1 на этой модифицированной гелевой системе с ростом и поддержанием в исходном (контрольном) протоколе. Здесь мы культивировали клетки O9-1 дикого типа на обеих гидрогелевых системах с модулем упругости 1 кПа и 40 кПа для каждой системы в базальной среде. Общий статус роста и развитие клеток визуализировали с помощью ярко-полевого светового микроскопа для апоптотических характеристик, подчеркнутой морфологии и прикрепления клеток к гидрогелям. Клетки O9-1, выращенные на исходной гелевой системе, приводили к увеличению количества мертвых клеток, что обусловливалось избытком круглых клеток(рисунок 3E,F)как для гидрогелей 1 кПа, так и для гидрогелей 40 кПа.
Напротив, клетки O9-1, выращенные на модифицированной гелевой системе, демонстрировали здоровый рост клеток и достаточное присоединение к гидрогелевому субстрату(рисунок 3G,H). Кроме того, совместимость NCC с модифицированной гидрогелевой системой оценивали путем выполнения окрашивания ПЧ маркера NCC Tcfap2α (AP-2). AP-2 является транскрипционным фактором, выраженным в линиях NC для регулирования развития у эмбрионов мышей, что делает его пригодным для оценки совместимости27. Хотя клетки O9-1, выращенные на контрольных и модифицированных гидрогелевых системах, экспрессировали AP-2, наблюдалось значительное увеличение экспрессии AP-2 в клетках O9-1, покрытых модифицированной гидрогелевой системой, о чем свидетельствует более сильный флуоресцентный сигнал и соответствующая количественная оценка(Рисунок 4A,B).
Кроме того, клетки P19 использовались для дальнейшего подтверждения преимуществ модифицированной гидрогелевой системы для роста клеток. P19 представляет собой клеточную линию эмбриональной карциномы, которая была получена из тератокарциномы эмбрионального происхождения у мыши28. Используя соответствующий протокол культивирования, клетки P19 выращивали как на контрольных, так и на модифицированных гидрогелевых системах для мониторинга характеристик выживания и роста. Визуализация Брайтфилда показала, что клетки P19, покрытые обеими гидрогелевыми системами, показали избыток круглых плавающих клеток и отсутствие прикреплений клеточногосубстрата (рисунок 3A-D). Это наблюдение свидетельствует о том, что модифицированный протокол больше подходит для ННК O9-1 для изучения механической сигнализации в ННК.
Визуализация экспрессии высоконапряженных волокон на жестких подложках
Модифицированный гидрогель позволил провести количественный и качественный анализ различий в морфологии клеток, культивируемых на гелях разного уровня жесткости и других эффекторах. Как только гидрогели были готовы к посеву клеток, клетки O9-1 дикого типа переходили на гидрогели с различными уровнями жесткости. Клетки контролировали за их здоровьем и ростом, наблюдая за их формой, пространственным распространением и даже прикреплением к гидрогелю с минимальным количеством мертвых клеток. Некоторые исследования показали увеличение стрессовых волокон и клеточной адгезии для МСК на субстратах с высокой жесткостью, предполагая, что NCC, выращенные на более жестком субстрате, также будут демонстрировать аналогичные результаты по сравнению с NCC, выращенными на более мягких субстратах29,30.
F-актин вместе с миозином II, α-актинином и другими цитоскелетными белками известны как стрессовые волокна31. В предыдущих исследованиях наблюдалось увеличение напряжения сборки волокон в ответ на увеличение механической силы31. На одном или обоих концах волокон напряжения прикрепления к комплексу фокальной адгезии позволяют клеткам мигрировать и прилипать к ECM31. Окрашивание фаллоидином для визуализации экспрессии и организации F-актина в NCC продемонстрировало здоровый рост клеток в ответ на механическую передачу сигналов(рисунок 5). Кроме того, клетки O9-1, выращенные на гидрогелях низкой или высокой жесткости, демонстрировали различную морфологию благодаря различному количеству напряжённых волокон(рисунок 5). Подобно наблюдениям из отчетных исследований, выполненных с использованием МСК, было замечено, что клетки O9-1, выращенные на более жестком субстрате, 40 кПа, демонстрировали больше стрессовых волокон и были хорошо распространены по сравнению с клетками, выращенными на более мягком гидрогеле, что указывает на жесткость 1 кПа29,30.
Оценка клеточных спаек
Чтобы еще больше подтвердить гипотезу о том, что изменение жесткости субстрата влияет на адгезию NCC, изменения в экспрессии Vcl были количественно измерены с помощью RT-qPCR в NCC, реагирующих на различные уровни жесткости гидрогеля. Vcl является одним из многочисленных цитоскелетных белков, присутствующих в комплексе фокальной адгезии в процессе установления контактов клетки с субстратом и определения свойств ECM32. Фокальные спайки являются точками контакта клеток с ECM через рецепторы интегрина, которые прикрепляются к цитоплазматическому актиновому цитоскелету, F-актину33 Уровень экспрессии гена Vcl предполагает изменения в очаговых спайках и клеточных спаек клетках O9-1 в ответ на жесткость субстрата.
Предыдущие исследования показали влияние Vcl на адгезию клеток в эмбриональных стволовых и фибробластных клетках по различиям в его экспрессии. В ответ на высокую экспрессию Vclколичество и размеры фокальных спаек также увеличились, но уменьшились, когда Vcl был сбитс ног 34. Последовательно Vcl-дефицитныеклетки также показали значительное снижение клеточной адгезии и распространения35. Кроме того, Vcl играет роль в регулировании клеточной адгезии путем стабилизации очаговых спаек36. Размер фокальных спаек, уровень созревания и составы варьируются в зависимости от жесткости субстрата, что позволяет сигналам трансдуцировать внутриклеточным образом и клеткам реагировать на их сигналы окружающей среды37. Таким образом, Vcl высоко рекрутируется в комплексы фокальной адгезии в клетках, выращенных на жестких субстратах, что отражается более высокими уровнями мРНК, обнаруженными с помощью RT-qPCR(рисунок 6C).
Клетки, выращенные на более мягких субстратах, образуют комплексы минимальной фокальной адгезии, что отражается более низкими уровнями мРНК Vcl в клетках15. На рисунке 6Cклетки O9-1 демонстрировали более высокую экспрессию Vcl на жесткой подложке, чем на мягкой подложке. Эти результаты свидетельствуют о более высоком уровне клеточно-субстратных адгезий клеток O9-1 на жестких субстратах, чем клеток O9-1 на более мягких субстратах. Кроме того, экспрессия Vcl была качественно визуализирована с помощью окрашивания ПЧ антителом против Vcl для дальнейшего дополнения и поддержки результатов RT-qPCR. Последовательно экспрессия Vcl в клетках O9-1, выращенных на более жестком субстрате, была выше, чем экспрессия, выращенная на более мягкой подложке(рисунок 6A,B),что дополнительно подтверждало первоначальное обнаружение высокой клеточной адгезии и распространения на гидрогеле 40 кПа по сравнению с гидрогелем 1 кПа, наблюдаемым при окрашивании фаллоидина F-актина и уровнях экспрессии Vcl через RT-qPCR.
Рисунок 1:Силовые кривые, генерируемые отступом зонда ОВМ. Сила (ось Y) указывает требуемую силу, приложенную в nN, а Z (ось x) указывает расстояние зонда Bruker AFM от образца в мкм. Для гидрогеля 1 кПа(А)генерируемый склон является пологим по сравнению с более крутым склоном, наблюдаемым для гидрогеля 40 кПа(В). Цветные кривые представляют собой движение консольного аппарата на зонде AFM, когда он приближается (синий) и втягивается (красный) от образца гидрогеля. Самая высокая начальная точка кривой указывает на жесткий контакт стеклянной крышки. (B)Большое падение втянутой кривой в гидрогеле 40 кПа указывает на адгезию между шариком и образцом. Аббревиатура: AFM = атомно-силовая микроскопия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Средняя жесткость гидрогелей (в кПа), рассчитанная по модулю упругости Юнга. Модуль Юнга был сгенерирован из кривых силы из рисунка 1. Указанные модули упругости гидрогелей составляли 0,5 кПа, 1 кПа, 10 кПа, 20 кПа и 40 кПа. Полосы ошибок указывают на стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Изображения яркого поля клеток P19 и O9-1, покрытых гидрогелями 1 кПа и 40 кПа контрольных и модифицированных гелевых систем для обнаружения характеристик роста клеток. (A-D) P19 и (E-H) O9-1 клеток; мертвые клетки обозначены красными стрелками. Шкала = 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Иммунофлуоресцентное окрашивание маркера NCC AP-2 в NCC O9-1 для визуализации совместимости NCC. (A)Модифицированная гидрогелевая система 40 кПа по сравнению с(B)контролем 40 кПа. АП-2 (зеленый); ядра окрашивались DAPI (синим цветом). Шкала баров = 25 мкм. (C) Гистограмма обеспечивает количественную оценку уровня выражения AP-2, показывающего значимость (p-value = 0,003) (n = 3). Данные показывают относительное выражение с заданными полосами ошибок стандартного отклонения. Сокращения: NCC = клетка нервного гребня; DAPI = 4′,6-диамидин-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Флуоресцентное окрашивание фаллоидином F-актина, показывающее стрессовые волокна, которые хорошо распределены в клетках O9-1 на гидрогеле 40 кПа. Клетки O9-1 культивировали на гидрогелях 1 кПа(A)и 40 кПа(B). Клетки O9-1 окрашивали с использованием фаллоидина Alexa Fluor 488 (зеленый), а ядра окрашивали DAPI (синий). Шкала стержней = 25 мкм. Аббревиатура: DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:Иммунофлуоресцентные изображения винкулина в клетках O9-1. Ячейки O9-1 были покрыты гидрогелями 1 кПа(A)и 40 кПа(B). Ядра были окрашены DAPI (синий). Шкала стержней = 25 мкм.(C)Количественный ПЦР-анализ общего уровня мРНК Vcl в клетках O9-1 в реальном времени, культивируемых на гидрогелях 1 кПа и 40 кПа. Уровень экспрессии Vcl на гидрогеле 1 кПа значительно ниже, чем на гидрогеле 40 кПа(p-значение = 0,02). Данные показывают среднее значение с предоставленными полосами ошибок стандартного отклонения. Аббревиатура: DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Общий объем 500 мкл | 0.5 кПа | 1 кПа | 10 кПа | 20 кПа | 40 кПа | ||
| 40% акриламид (мкл) | 37.5 | 62.5 | 125 | 100 | 100 | ||
| 20% бис-акриламид (мкл) | 15 | 7.5 | 25 | 66 | 120 | ||
| H2O (мкл) | 447.5 | 430 | 350 | 334 | 280 | ||
| 10% APS (мкл) | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | ||
| ТЕМЕД (мкл) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | ||
Таблица 1: Соответствующие объемы растворов для получения желаемых уровней жесткости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Целью текущего исследования является обеспечение эффективной и действенной системы in vitro для лучшего понимания воздействия механических сигналов в NCC. В дополнение к следу пошаговому протоколу, упомянутому выше, исследователи должны иметь в виду, что клеточная культура NCC O9-1 зависит от типа стеклянных покровов, используемых для приготовления гидрогелей. Например, было отмечено, что клетки, посеянные на определенный тип стеклянной крышки (см. Таблицу материалов),выживали и хорошо размножались, в то время как культивируемые клетки, посеянные на других типах стеклянных покровов, демонстрировали большую гибель клеток. Кроме того, важно строго следовать правильным условиям клеточной культуры для O9-1 NCC38. Качество клеточной культуры является оптимальным, когда гидрогели используются как можно скорее или хранятся в стерильном инкубаторе при 37 °C в течение двух дней.
Из-за чувствительности каждого компонента в протоколе модули упругости могут варьироваться в зависимости от эксперимента. В дополнение к пунктам, упомянутым в протоколе (шаг 1.3.2) относительно 10% APS, другие критические факторы, которые следует иметь в виду, также влияют на изменение. Другим фактором, который, как подозревалось, вызывал большие различия в измерениях ОВМ, была толщина гидрогелей. Предыдущее исследование изучало влияние толщины на модули Юнга, варьирующиеся от 15 до 1000 мкм, и обнаружило, что различия в толщине существенно не изменяют модули Юнга39. Однако толщина субстратов также влияет на механические свойства, которые клетки могут ощущать, что приводит к различным морфологиям40,41,42. Различные исследования показали, что значительное увеличение толщины гидрогелей приводило к уменьшению площади клеток, распространению и эффективной жесткости гидрогелей40,41,42. Однако фенотипы клеток также изменяются в ответ на значительно тонкие гидрогели, например, более высокое распространение даже на гидрогели низкой жесткости40,41,42. При постоянном объеме полиакриламидных гелей толщина гидрогелей должна быть равномерной, чтобы незначительные отклонения не оказывали существенного влияния на модуль упругости при измерениях АСМ.
Лучше стерилизовать крышки, передавая их туда и обратно в пламя с помощью спиртовой горелки, потому что другие методы стерилизации могут быть более сложными и вызывать потенциальное повреждение стеклянных крышек. Различные размеры стеклянных крышек могут быть использованы на основе экспериментальных требований. Этот протокол использовал 12-мм и 25-мм обшивки для иммуногистохимии и RT-qPCR соответственно. Использование гелей соответствующего размера в соответствии с экспериментами повышает эффективность и сводит к минимуму отходы. Эти модификации были проверены качественно и количественно для обеспечения оптимизации для O9-1 NCC по сравнению с исходной (контрольной) гидрогелевой системой20. Общее состояние здоровья и рост NCC O9-1 оценивали под микроскопом яркого поля для характеристик клеточного и субстратного прикрепления.
Кроме того, сравнивали совместимость клеток O9-1 между контрольной и модифицированной гидрогелевыми системами для дальнейшей проверки модификаций в этом протоколе путем качественной визуализации экспрессии AP-2 с использованием окрашивания ПЧ. Интенсивность сигналов была количественно определена для дальнейшей поддержки репрезентативных изображений экспрессии AP-2 в клетках O9-1 между контрольными и модифицированными гидрогелевыми системами. В то время как AP-2 является распространенным маркером NCC, другие хорошо известные маркеры должны быть рассмотрены для проверки, такие как Sox10 и Pax3, из-за их значимости для поддержания NCC плюрипотентности и выживаемости28. Кроме того, оптимизация в этом протоколе была дополнительно подтверждена путем сравнения ячеек СПУ O9-1 с другой клеточной линией, P19, чтобы убедиться, что эта гидрогелевая система эффективна и надежна для ячеек С ЧПУ. Хотя клетки P19 имеют бессмертные характеристики и легко культивируются, они не процветали ни на одной из гидрогелевых систем.
Сопротивление силе удлинения, создаваемой субстратом или жесткостью ткани, где клетки прикрепляются, часто выражается в виде модуля упругости Юнга45. С помощью AFM модуль упругости Юнга получается из кривой силы, полученной из приложенной вертикальной силы26. Во время измерения AFM могут возникать большие различия между измерениями, которые могут привести к неточным показаниям для более жестких гидрогелей. Несоответствие может быть вызвано неправильными зондами, используемыми для измерения. Например, для измерения гидрогелей 20 кПа и 40 кПа требуется использование более жесткого зонда с более высокой постоянной пружины (k = 0,24 Н/м). Более жесткий зонд обеспечивает более низкое разрешение по сравнению с более мягким зондом; тем не менее, есть основания отдавать предпочтение выбору более жесткого зонда, поскольку слишком мягкие консольные можно было бы придерживаться образцов46. Кроме того, слишком мягкие зонды очень чувствительны, способствуя ложным сигналам от нежелательных частиц и приводя к искусственно более низким или более высоким значениям жесткости, чем истинная жесткость46. Кроме того, необходимо отметить точный ввод коэффициента Пуассона в зависимости от измерительного материала; это можно найти в стандартизированных исследованиях, поскольку это существенно влияет на вывод данных.
Кроме того, AFM использовался для измерения толщины гидрогелей, так как толщина является еще одним механическим свойством, влияющим на то, как клетки воспринимаютокружающую среду 47,42. В различных исследованиях клетки, выращенные на мягких гидрогелях, имеют круглую форму при и за пределами «критической толщины», которая, как сообщается, составляет ~ 2-5 мкм, в зависимости от типа клеток47,42,48. Однако гораздо более высокое распространение наблюдалось, когда клетки покрывались гидрогелями той же жесткости, но меньшей толщины, чем «критическая толщина»42,48. Потенциальное объяснение этого интересного открытия заключается в том, что субкритическая толщина гидрогелей позволяет клеткам ощущать жесткие подстилающие стеклянные покровы, когда клетки оказывают тягу для бокового смещения47. Средняя толщина гидрогелей полной жесткости составила 342 мкм со стандартным отклонением 27 мкм. Толщина гидрогелей была выше, чем предложенная «критическая толщина», и в пределах испытательного диапазона менее 400 мкм, о котором сообщалось в исследованиях и изготовленных предварительно изготовленных гидрогелях, так что клетки могли ощущать различную жесткость гидрогелей, а не лежащие в их основе жесткие стеклянные крышки42,48.
В дополнение к методу количественного анализа AFM, гидрогели также были качественно проанализированы с помощью иммуногистохимии для изучения экспрессии маркеров, затронутых различной жесткостью в клетках O9-1, и для визуализации здорового роста клеток. F-актин в цитоплазме соединен с мембраносвязанными интегринами через набор цитоскелетных белков, таких как талин и Vcl, образуя комплекс фокальной адгезии33. Экспрессия стрессовых волокон в клетках также может быть проанализирована путем измерения экспрессии других цитоскелетных генов в клетках, таких как талин и интегрин, которые могут быть визуализированы вместе с использованием набора для окрашивания фокальной адгезии.
Существовали различные степени жесткости гидрогеля, которые влияли на морфологию и реакцию NCC, что видно по изменению адгезии клеток и волокон напряжения посредством механической передачи сигналов. Этот протокол предлагает возможность влиять на дифференцировку клеток в различные типы клеток путем модификации соответствующих условий культивирования in vitro,обеспечивая тем самым удобный метод манипулирования механическими сигналами и химическими сигналами в NCC. Как упоминалось ранее, судьба дифференцировки NCC в значительной степени определяется механическими силами, присутствующими в окружающих тканях, включая их жесткость2,3. Хотя ближайшая цель настоящего документа заключалась в разработке пошагового протокола для подготовки гидрогелей для культуры NCC, потенциальные преимущества этого протокола выходят за рамки методологии, стремясь к дальнейшему знанию механической сигнализации в NCC. Также стоит отметить, что данная система in vitro имеет некоторые ограничения. Этот метод изготовления гидрогелей включает в себя несколько этапов, которые потенциально могут внести технические изменения на этом пути, включая гетерогенность, неровную поверхность и неточную жесткость. Поэтому пользователи должны выполнять эти шаги осторожно, чтобы свести к минимуму технические отклонения во время экспериментов. Кроме того, полиакриламидные гели в этой системе ограничили исследования 2D-культурой из-за токсичности акриламида, игнорируя точную 3D-биологическую среду, в которой NCC населяют50.
Несмотря на эти ограничения, эта система in vitro позволяет использовать недорогой и простой метод, приносящий пользу всем уровням исследований и позволяющий исследователям выполнять достаточные и функциональные тесты. Как видно из недавних результатов, NCC в значительной степени полагаются как на механическую сигнализацию, такую как сила сдвига и жесткость субстрата, так и на химическую сигнализацию, такую как сигнализация фактора роста Wnt и фибробластов, в черепно-лицевом, а также на развитие сердца у позвоночных6,15. Используя этот протокол, локальные микросреды для экспериментов in vitro могут быть легко имитированы для будущих исследований NCC, включая дифференцировку, миграцию, клеточные реакции и потенциал прогрессирования вредного заболевания. Таким образом, эта система in vitro станет мощным инструментом для изучения роли механической сигнализации в NCC и их взаимодействия с другими сигнальными путями, что углубит понимание молекулярно-генетических механизмов развития NCC и связанных с ним заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Мы благодарим д-ра Ана-Марию Заске, оператора установки Atomic Force Microscope-UT Core в Центре медицинских наук Техасского университета, за вклад в AFM в этом проекте. Мы также благодарим источники финансирования от Национальных институтов здравоохранения (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 и R01HL142704 J. Wang).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-012 | |
| 2% Bis-Acrylamide | Sigma Aldrich | M1533 | |
| 24-well plate | Greiner Bio-one | 662165 | |
| 25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-025 | |
| 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | A3648 | |
| 4-well cell culture plate | Thermo Scientific | 179830 | |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | J61899-AP | |
| 40% Acrylamide | Sigma Aldrich | A4058 | |
| 50% glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G7651 | |
| 6-well cell culture plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| AFM cantilever (spherical bead) | Novascan | ||
| AFM software | Catalyst NanoScope | Model: 8.15 SR3R1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher | A12379 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 248614 | Powder |
| anti-AP-2α Antibody | Santa Cruz | sc-12726 | |
| anti-Vinculin antibody | Abcam | ab129002 | |
| Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst | Bruker Corporation | ||
| Collagen type I (100mg) | Corning | 354236 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dichloromethylsilane (DCMS) | Sigma Aldrich | 440272 | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fluorescence microscope | Leica | Model DMi8 | |
| Fluoromount-G mounting medium | SouthernBiotech | 0100-35 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Powder |
| Horse serum | Corning | 35-030-CI | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad | 1708841 | |
| Penicillin-Streptomycin antibiotic | Thermo Fisher | 15140148 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| Sterile 1x PBS | Hyclone | SH30256.02 | |
| Sterile deionized water | Hardy Diagnostics | U284 | |
| sulfo-SANPAH | Thermo Fisher | 22589 | |
| SYBR green | Applied Biosystems | 4472908 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
References
- Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
- Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Developmental Biology. 419 (2), 199-216 (2016).
- Watt, K. E. N., Trainor, P. A. Neurocristopathies: the etiology and pathogenesis of disorders arising from defects in neural crest cell development. Neural Crest Cells-Evolution, Development and Disease. Trainor, P. A. , Academic Press. 361-394 (2014).
- Lavelle, C. L. B. Applied oral physiology. , Butterworth-Heinemann. (1988).
- Chin, L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nature Reviews Cancer. 3 (8), 559-570 (2003).
- Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Wang, Q., et al. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
- Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
- Barriga, E. H., Franze, K., Charras, G., Mayor, R. Tissue stiffening coordinates morphogenesis by triggering collective cell migration in vivo. Nature. 554 (7693), 523-527 (2018).
- Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
- Mason, D. E., et al. YAP and TAZ limit cytoskeletal and focal adhesion maturation to enable persistent cell motility. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1369-1389 (2019).
- Dupont, S., et al.
- Lu, Y. -B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Georges, P. C., Miller, W. J., Meaney, D. F., Sawyer, E. S., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
- Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
- Engler, A., Sweeney, H., Discher, D., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 7 (4), 335 (2007).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. Journal of Cell Science. 121 (22), 3794-3802 (2008).
- Robling, A. G., Turner, C. H. Mechanical signaling for bone modeling and remodeling. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 19 (4), 319-338 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 10, Unit 10.16 (2010).
- Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2089 (2010).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
- Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Varying solvent type modulates collagen coating and stem cell mechanotransduction on hydrogel substrates. APL Bioengineering. 3 (3), 036108 (2019).
- Fedoroff, S., Hall, C. Effect of horse serum on neural cell differentiation in tissue culture. In vitro. 15 (8), 641-648 (1979).
- Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
- Mitchell, P. J., Timmons, P. M., Hébert, J. M., Rigby, P., Tjian, R. Transcription factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mouse embryogenesis. Genes & Development. 5 (1), 105-119 (1991).
- Wegner, M. Neural crest diversification and specification: transcriptional control of Schwann Cell differentiation. Encyclopedia of Neuroscience. , 153-158 (2010).
- Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
- Sun, M., et al. Effects of matrix stiffness on the morphology, adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (3), 257 (2018).
- Burridge, K., Guilluy, C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension. Experimental Cell Research. 343 (1), 14-20 (2016).
- Burridge, K. Focal adhesions: a personal perspective on a half century of progress. The FEBS Journal. 284 (20), 3355-3361 (2017).
- Zhou, C., et al. Compliant substratum modulates vinculin expression in focal adhesion plaques in skeletal cells. International Journal of Oral Science. 11 (2), 1-9 (2019).
- Fernández, J. L. R., Geiger, B., Salomon, D., Ben-Ze'ev, A. Overexpression of vinculin suppresses cell motility in BALB/c 3T3 cells. Cell Motility and the Cytoskeleton. 22 (2), 127-134 (1992).
- Coll, J., et al. Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9161-9165 (1995).
- Saunders, R. M., et al. Role of vinculin in regulating focal adhesion turnover. European Journal of Cell Biology. 85 (6), 487-500 (2006).
- Kuo, J. -C. Focal adhesions function as a mechanosensor. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 126, 55-73 (2014).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58346 (2018).
- Kolewe, K. W., Zhu, J., Mako, N. R., Nonnenmann, S. S., Schiffman, J. D. Bacterial adhesion is affected by the thickness and stiffness of poly (ethylene glycol) hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (3), 2275-2281 (2018).
- Lin, Y. -C., et al.
- Mullen, C. A., Vaughan, T. J., Billiar, K. L., McNamara, L. M. The effect of substrate stiffness, thickness, and cross-linking density on osteogenic cell behavior. Biophysical Journal. 108 (7), 1604-1612 (2015).
- Tusan, C. G., et al. Collective cell behavior in mechanosensing of substrate thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
- McBurney, M. W., Jones-Villeneuve, E. M., Edwards, M. K., Anderson, P. J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature. 299 (5879), 165-167 (1982).
- Hasegawa, A., Shirayoshi, Y. P19 cells overexpressing Lhx1 differentiate into the definitive endoderm by recapitulating an embryonic developmental pathway. Yonago Acta Medica. 58 (1), 15 (2015).
- Wells, R. G.
- Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
- Butler, J. P., Tolic-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Leong, W. S., et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (2), 287-292 (2010).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Funaki, M., Janmey, P. A. Technologies to engineer cell substrate mechanics in hydrogels. Biology and Engineering of Stem Cell Niches. , Academic Press. 363-373 (2017).
