Summary
Detaljerede trin-for-trin protokoller er beskrevet her for at studere mekaniske signaler in vitro ved hjælp af multipotent O9-1 neurale crest celler og polyacrylamid hydrogels af varierende stivhed.
Abstract
Neurale crest celler (NCCs) er hvirveldyr embryonale multipotent celler, der kan migrere og differentiere sig til en bred vifte af celletyper, der giver anledning til forskellige organer og væv. Vævsstivhed producerer mekanisk kraft, en fysisk cue, der spiller en afgørende rolle i NCC differentiering; Mekanismen er dog fortsat uklar. Den metode, der er beskrevet her, giver detaljerede oplysninger til den optimerede generering af polyacrylamidhydrogeler af varierende stivhed, nøjagtig måling af en sådan stivhed og evaluering af virkningen af mekaniske signaler i O9-1-celler, en NCC-linje, der efterligner in vivo NCCs.
Hydrogel stivhed blev målt ved hjælp af atomprøvesprængningsmikroskopi (AFM) og indikerede forskellige stivhedsniveauer i overensstemmelse hermed. O9-1 NCCs kultiveret på hydrogeler af varierende stivhed viste forskellige cellemorfologi og genekspression af stressfibre, hvilket indikerede varierende biologiske virkninger forårsaget af mekaniske signalændringer. Desuden fastslog dette, at varierende hydrogel stivhed resulterede i et effektivt in vitro-system til at manipulere mekanisk signalering ved at ændre gel stivhed og analysere molekylær og genetisk regulering i NCCs. O9-1 NCCs kan differentiere sig til en bred vifte af celletyper under indflydelse af de tilsvarende differentiering medier, og det er praktisk at manipulere kemiske signaler in vitro. Derfor er dette in vitro-system et kraftfuldt værktøj til at studere den rolle, som mekanisk signalering i NCCs og dets interaktion med kemiske signaler, som vil hjælpe forskerne med bedre at forstå de molekylære og genetiske mekanismer i neural crest udvikling og sygdomme.
Introduction
Neurale crest celler (NCCs) er en gruppe af stamceller under hvirveldyr embryogenese med en bemærkelsesværdig evne til at migrere og bidrage til udviklingen af forskellige organer og væv. NCC'er kan differentiere sig til forskellige celletyper, herunder sensoriske neuroner, brusk, knogle, melanocytter og glatte muskelceller, afhængigt af placeringen af aksial oprindelse og den lokale miljøvejledning af NCC1,2. Med evnen til at differentiere sig til en bred vifte af celletyper kan genetiske abnormiteter, der forårsager dysregulering på ethvert stadium af neural crest (NC) udvikling, føre til mange medfødte sygdomme2. For eksempel fører forstyrrelser under dannelsen, migrationen og udviklingen af NCC'er til udviklingsforstyrrelser kendt kollektivt som neurocristopathies1,3. Disse sygdomme spænder fra kraniofaciale defekter på grund af svigt i NCC dannelse, såsom Treacher Collins syndrom, til udvikling af forskellige kræftformer på grund af NCC metastatisk migrationsevne, som det ses i melanom3,4,5,6. I løbet af de sidste par årtier har forskere gjort bemærkelsesværdige opdagelser om ncc'ernes roller og mekanismer i udvikling og sygdomme, hvor de fleste resultater er fokuseret på kemiske signaler7,8. For nylig er mekaniske signaler blevet angivet til at spille en kritisk, men dårligt forstået rolle i NCC udvikling9,10.
De miljømæssige signaler fra de nationale konkurrencemyndigheder spiller en afgørende rolle under deres udvikling, herunder regulering af NCC-differentiering i forskellige celletyper. Miljømæssige signaler, f.eks. fysiske signaler, indflydelse på afgørende adfærd og cellulære reaktioner, såsom funktionel diversificering. Mechanotransduction gør det muligt for celler at fornemme og reagere på disse signaler for at opretholde forskellige biologiske processer2. NCCs er omgivet af tilstødende celler og forskellige substrater, såsom den ekstracellulære matrix (ECM), som kan give anledning til mekaniske stimuli til at opretholde homøostase og tilpasse sig ændringerne gennem skæbnebestemmelse, spredning og apoptose11. Mechanotransduktion begynder ved plasmamembranen, hvor den sensoriske komponent af mekaniske ekstracellulære stimuli opstår, hvilket resulterer i intracellulær regulering af cellen12. Integrins, fokale vedhæftninger og knudepunkter af plasmamembranen videresender mekaniske signaler, såsom forskydningskræfter, stress og stivheden af de omgivende substrater, i kemiske signaler til fremstilling af cellulære reaktioner12. Videresendelse af kemiske signaler fra plasmamembranen til den endelige cellulære regulering udføres via forskellige signalveje for at færdiggøre vitale processer for organismen, såsom differentiering.
Flere undersøgelser har antydet, at mekanisk signalering fra substrat stivhed spiller en rolle i celledifferentiering13,14. For eksempel har tidligere undersøgelser vist, at mesenkymale stamceller (MSC'er) dyrket på bløde substrater med en stivhed svarende til hjernevæv (i intervallet 0,1-1,0 kPa) resulterede i neuronal celledifferentiering15,16. Men flere MSC'er differentiere sig i myocyt-lignende celler, når de dyrkes på 8-17 kPa substrater efterligne stivhed af muskler, mens osteoblast-lignende differentiering blev observeret, når MSC'er blev dyrket på stive substrater (25-40 kPa)15,16. Betydningen af mechanotransduktion fremhæves af uregelmæssigheder og abnormiteter i den mekaniske signalvej, der potentielt fører til alvorlige udviklingsdefekter og sygdomme, herunder kræft, hjerte-kar-sygdomme og osteoporose17,18,19. I kræftformer, normalt brystvæv er blødt, og risikoen for brystkræft stiger i stiv og tæt brystvæv, et miljø, der er mere beslægtet med brysttumorer15. Med denne viden kan virkningerne af mekanisk signalering på NCC-udvikling studeres gennem simpel manipulation af substratstivhed gennem et in vitro-system, hvilket giver yderligere fordele og muligheder for at forstå de grundlæggende elementer i NC-relateret sygdomsprogression og ætiologi.
For at studere virkningen af mekaniske signaler i NCCs etablerede vi et effektivt in vitro-system til NCCs baseret på optimering af tidligere offentliggjorte metoder og evaluering af NCCs svar på forskellige mekaniske signaler20,21. Der blev fastsat en detaljeret protokol til varierende hydrogelstivhedsforberedelse og evaluering af virkningen af mekanisk signalering i ncc'er. For at opnå dette, O9-1 NCCs anvendes som NC model til at studere effekter og ændringer som reaktion på stive versus bløde hydrogels. O9-1 NCCs er en stabil NC cellelinje isoleret fra musefoster (E) på dag 8.5. O9-1 NCCs efterligner NCCs in vivo, fordi de kan differentiere sig til forskellige NC-afledte celletyper i defineret differentieringsmedie22. For at studere den mekaniske signalering af NCC'er blev et matrixsubstrat fremstillet med tunabel elasticitet fra varierende koncentrationer af acrylamid- og bis-acrylamidopløsninger for at opnå den ønskede stivhed, der korrelerede med den biologiske substratstivhed20,21,23. For at optimere betingelserne for matrixsubstrat til NCC'er, specielt O9-1-celler, blev der foretaget ændringer fra den tidligere offentliggjorte protokol20. En ændring foretaget i denne protokol var at inkubere hydrogeler i kollagen I, fortyndet i 0,2% eddikesyre i stedet for 50 mM HEPES, ved 37 °C natten over. Den lave pH af eddikesyre fører til en homogen fordeling og højere kollagen I inkorporering, hvilket giver mulighed for en mere ensartet fastgørelse af ECM protein24. Derudover blev der anvendt en kombination af hesteserum og fosterkvægserum (FBS) i koncentrationerne på henholdsvis 10 % og 5 % i fosfatbuffersalin (PBS), inden hydrogelerne blev opbevaret i inkubatoren. Hesteserum blev brugt som et ekstra supplement til FBS på grund af dets evne til at fremme cellespredning og differentiering i koncentration af 10%25.
Med denne metode blev et biologisk miljø efterlignet af ECM-proteinbelægningen (f.eks. Kollagen I) for at skabe et nøjagtigt in vitro-miljø, så NCCs kunne vokse og overleve20,21. Stivheden af de forberedte hydrogeler blev kvantitativt analyseret via atomprøvesprængningsmikroskopi (AFM), en velkendt teknik til at skildre den elastiske modulus26. For at studere effekten af forskellige stivhedsniveauer på NCCs blev de vilde O9-1-celler kultiveret og forberedt på hydrogeler til immunfluorescence (IF) farvning mod filamentøs actin (F-actin) for at vise forskellene i celle vedhæftning og morfologier som reaktion på ændringer i substratstivhed. Ved hjælp af dette in vitro-system vil forskere være i stand til at studere rollerne af mekanisk signalering i NCCs og dets interaktion med andre kemiske signaler for at få en dybere forståelse af forholdet mellem NCCs og mekanisk signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hydrogel forberedelse
BEMÆRK: Alle trin skal udføres i en cellekulturhætte, der er desinficeret med ethanol og ultraviolet (UV)steriliseret før brug for at opretholde steriliteten. Værktøj, såsom pincet og pipetter, skal sprøjtes med ethanol. Bufferopløsninger skal også sterilfiltrere.
- Fremstilling af aminosilanebelagte glasovertræk
- Placer det ønskede antal glasovertræk på et stykke laboratoriestørring.
BEMÆRK: Forbered yderligere 3-4 coverlips for at sikre tilstrækkelige backup forsyninger, når de bryder let. Forskellige materialer af glas coverlips vil give forskellige kompatibilitet af celle såning og vedhæftet fil. Det er bedre at afgøre, hvilken type der passer bedst til eksperimentet, før du starter eksperimenterne (se materialetabellen). - Brug en alkoholbrænder eller Bunsen brænder til at sterilisere hver coverslip ved at sende det frem og tilbage gennem flammen (30 s for protein assay eksperimenter). Placer hvert glas coverlip på et laboratorium tørre at køle ned.
- Når glasdækslerne er afkølet, overføres de til en petriskål foret med parafilm for at forhindre skred.
BEMÆRK: Hvis dækslerne ikke er kølige nok, smelter restvarmen parafilmen på gliderne, hvilket gør dem ubrugelige. - Dæk dækslerne med ca. 200 μL og 800 μL på 0,1 M NaOH for henholdsvis en 12 mm og en 25 mm coverslip, og lad dem sidde i 5 min. Derefter aspirere 0,1 M NaOH og lad coverlips til lufttørre i yderligere 5 minutter til at danne en jævn film.
- Når dækslerne er tørret, pipette ca. 80 μL og 150 μL 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) for henholdsvis 12 mm og 25 mm coverslips. Vær forsigtig med at undgå at spilde opløsningen på parafilmen. Lad opløsningen sidde i 5 min.
- Aspirere så meget overskydende APTS som muligt og lad de resterende APTS tørre i 5 min. Skyl dækslerne godt ved at nedsænke dem i sterile, deioniserede (DI) H2O tre gange i 5 min hver gang.
BEMÆRK: Hvis glasovertrækket ikke skylles godt, forårsager de resterende APTS uønskede reaktioner med glutaraldehyd, hvilket får en hvid bundfald til at danne sig og resulterer i ubrugelige coverlips. - Flyt coverlips til en ny Petriskål med den reaktive side med forsiden nedad. Tilsæt nok 0,5% glutaraldehyd til Petriskålen til at dække dækslerne helt og lad coverlips til at sidde i 30 min.
- Aspirer 0,5% glutaraldehyd og skyl dækslerne igen i DI H2O én gang i 3 min. Indstil coverlips reaktiv side op på et laboratorium tørre eller en ren Petri fad til lufttørre helt før brug.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her; coverslips skal anbringes sterilt DI H2O, indtil de tages i brug.
- Placer det ønskede antal glasovertræk på et stykke laboratoriestørring.
- Fremstilling af silikone coverslips
- Det samme antal coverslips som de aminosilanebelagte coverslips (trin 1.1.1) placeres i en petriskål foret med parafilm.
- Pipette 40 μL eller 150 μL til henholdsvis 12 mm og 25 mm dæksler af dichloromethylsilane (DCMS) til den ene side af dækslerne og lade opløsningen sidde i 5 min.
- Aspirer enhver resterende opløsning fra dækslet, vask i steril DI H2O én gang i 1 min, og placer de reaktive coverlips med billedsiden nedad på en laboratorieaftørsker helt, før du går videre til næste trin.
- Forberedelse af hydrogels
- Bland acrylamid, bis-acrylamid og DI H2O i et 1,5 mL centrifugerør til fremstilling af 500 μL opløsninger med varierende stivheder (se tabel 1). Vortex opløsningen til 30 s til at blande det grundigt.
- Hvis du arbejder hurtigt, tilsættes 10% ammoniumpersulfatopløsningen (APS) og tetramethylethylendiamin (TEMED) til røret og hvirvler opløsningerne igen for at blande løsningerne.
BEMÆRK: Forbered frisk 10% APS og lad den stå på is eller fryse til engangs aliquots på grund af dens følsomme fryse /optø cyklus. - Pipette ca. 33 μL eller 100 μL af opløsningen på de tørrede 12 mm eller 25 mm aminosilanebelagte dæksler (henholdsvis punkt 1.1).
- Ved hjælp af buede pincet skal du straks placere den DCMS-behandlede coverlip oven på gelopløsningen med den behandlede side, der rører gelopløsningen, og derved sandwicher gelopløsningen mellem den DCMS-behandlede coverslip og aminosilanebelagt coverlip.
- Lad gelopløsningen polymerisere i 5-15 min, mens der aktivt overvåges for gelpolymerisering af den resterende opløsning i røret.
- Når gelen er polymeriseret, adskille DCMS-behandlede coverslip med buede pincet eller et barberblad, forlader gelen fastgjort til den oprindelige aminosilane-coated coverlip.
- Dækslet med den påsatte hydrogel placeres straks i en forudbestemt 4-brønd/24-brønd og 6-brønds plade dækket med henholdsvis 500 μL og 2 ml steril PBS eller DI H2O til henholdsvis 12 mm og 25 mm dæksler for at forhindre gelen i at tørre ud.
- Gentag trin 1.3.4-1.3.7 for alle dæksler.
- Dyk hydrogelerne ned i steril PBS eller DI H2O i 30 min for at fjerne overskydende acrylamidopløsning. Opbevar hydrogelerne i steril PBS eller DI H2O ved 4 °C for et proceduremæssigt stop her.
- I et mørkt rum, forberede sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoat (sulfo-SANPAH) blanding ved at blande 2,5 ml 50 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl] ethanesulfonsyre(HEPES) (pH=8,5) med 25 μL af de 50 μg/mL sulfo-SANPAH i et konisk rør, indpakket i aluminium for at beskytte mod lys. Brug en pipette til at blande opløsningen godt før brug.
BEMÆRK: Et volumen på 2,5 ml sulfo-SANPAH-opløsning er nok til ca. 25 12 mm hydrogeler eller fem 25 mm hydrogeler. - Aspirere PBS eller DI H2O fra brøndpladen. Der tilsættes ca. 100 μL eller 500 μL til henholdsvis 12 mm og 25 mm dæksler af sulfo-SANPAH-opløsning (trin 1.3.10) til at dække gelen. Sørg for, at opløsningen dækker gelen helt.
BEMÆRK: Juster vakuumsugningsstyrken for at forhindre, at den stærke kraft river eller forstyrrer hydrogelerne. - Anbring gelerne med opløsningen under et 15 W, 365 nm UV-lys i 10 min, afdækket for at minimere enhver interferens af UV-lyset, der reagerer med sulfo-SANPAH.
- Aspirer den overskydende sulfo-SANPAH ved at vippe pladen for at opsamle så meget af opløsningen som muligt. Vask gelen med 50 mM HEPES to til tre gange.
- Tilsæt henholdsvis 500 μL og 2 ml til henholdsvis 12 mm og 25 mm geler på 50 mg/ml kollagen, som jeg fortyndede i 0,2% eddikesyre til hver brønd, der indeholder hydrogelen. Lad gelerne inkubere natten over i en 37 °C, 5% CO 2-inkubator.
BEMÆRK: Fortynd kollagen I i 0,2% eddikesyre i stedet for 50 mM HEPES for at fremme homogen distribution og fastgørelse af kollagen I. - Aspirere kollagen I og vaske geler med steril PBS tre gange for at fjerne overskydende kollagen I i 5 min hver vask. Inkuber hydrogelerne i PBS med 10% hesteserum, 5% FBS i 2 timer i 37 °C, 5% CO 2-inkubatoren.
BEMÆRK: Tilføjelsen af 10% hesteserum fremmer højere spredning sammenlignet med kun at bruge FBS som gjort i den foregående publikation. - Aspirere mediet. Tilføj 500 mL steril-filtreret Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin (P / S) til hver brønd. Gelerne opbevares i 37 °C, 5 % CO 2-inkubatoren, indtil de er klar til cellekultur.
- Når du er klar, plade ca 1,5 × 104 O9-1 celler / cm2 i basal medium i kultur retter. Inkuberes cellerne i 2 dage i en inkubator ved 37 °C, 5% CO2. Kontroller cellerne for sammenløb for at sikre, at cellerne er tilstrækkeligt knyttet til geler, og at antallet af celler er nok, før indsamling til analyse.
BEMÆRK: Se den tidligere offentliggjorte protokol for trinene til gendannelse, passage og samling af O9-1-celler20. - Fortsæt til afsnit 2, 3 eller 4 til yderligere analyse af hydrogelerne.
2. Kvantitativ analyse af stivhed via AFM
- Start AFM-systemcomputeren efterfulgt af AFM-controlleren (se materialetabellen).
- Monter AFM-cantilever på AFM-sondeholderen. Brug en sfærisk cantilever med en 0,5 μm silica perle monteret for enden af cantilever (cantilever med sfærisk perle).
BEMÆRK: For stivere hydrogels, såsom 10 kPa, 20 kPa og 40 kPa, blev der brugt en stivere sonde med fjederkonstanten på 0,24 N/m. En blødere sonde blev brugt til blødere hydrogeler, såsom 0,5 kPa og 1 kPa, med en fjederkonstant på 0,059 N/m. - Indstil AFM-softwaren under kontakttilstand.
- Monter silicium wafer på AFM prøve fase for at indsamle kraft kurver ved at klikke på Engage for cantilever at røre silicium substrat, og dermed generere kraft kurver.
- Brug kraftkurverne ovenfor (2.4) til kalibrering, klik på Kalibrer i den styrende software for at opnå en gennemsnitlig fjederkonstant af cantilever under termisk tune stand, og gem de kalibrerede værdier i den styrende software.
- Monter prøverne ved at placere coverlip med den vedhæftede hydrogel i en 60 mm petriskål på AFM scanningsstadiet. Tilsæt 3 mL PBS i fadet, før der foretages målinger for at forhindre gelen i at tørre ud.
- Indstil AFM til at arbejde i kontakttilstand (væske) for at starte målingen. Sæt den sfæriske perle i gang for løbende at røre ved og løfte fra gelprøven.
- Indstil cantilever, så dens afbøjningstærskel forbliver på 10 nm. Sodens rampingstørrelse holdes på 10 μm. Registrer derefter kraftkurverne som i trin 2.4.
- Erhverve mindst 20 kraft kurver fra mindst 3 til 10 forskellige pletter på tværs af overfladen af hydrogel.
- Beregn den gennemsnitlige Young's modulus af ~ 20 kraft kurver for hvert sted med AFM billedbehandling og analyse software. Brug udvide rampe kraft kurver og en lineariseret model (sfærisk). Beregn gennemsnittet af alle pletter for hver prøve for at give den endelige stivhed.
BEMÆRK: Youngs modulus og relaterede data (dvs. standardafvigelser) gemmes automatisk som et regneark. - Gentag trin 2.6-2.10 for alle prøver.
3. Molekylær analyse af stivhed via immunofluorescence farvning
- Brug pincet til at transportere coverlip til en ny plade for at minimere falske signaler fra celler dyrket direkte på pladen. Vask cellerne med 500 μL steril PBS tre gange for at fjerne døde celler og eventuelle resterende kulturmedier.
- Fastgør cellerne ved hjælp af 500 μL på 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 min ved stuetemperatur, uforstyrret. Derefter vaskes cellerne tre gange ved hjælp af 500 μL PBS / brønd i 2 min hver.
BEMÆRK: Opbevar ved 4 °C for et procedurestop. - Behandl cellerne med 500 μL på 0,1% Triton X-100 i 15 min ved stuetemperatur. Vask derefter cellerne tre gange med 500 μL PBS/brønd.
- Bloker cellerne med 250 μL 10% æselserum (fortyndet i PBS og 0,1% Mellem 20) pr. brønd i 30 min ved stuetemperatur.
- Inkuberes cellerne med 250 μL primære antistoffer i 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C. Vask derefter cellerne tre gange med 500 μL PBS/brønd i 5 min hver.
BEMÆRK: Anti-Vinculin (Vcl) (1:250) og anti-AP2 alpha (1:250) blev anvendt i dette eksperiment og blev fortyndet i 10% æsel serum. - Inkuberes cellerne med tilsvarende sekundære antistoffer og/eller phalloidin, der anvendes til F-actin-farvning ved en fortynding på 1:400 i 250 μL på 10% æselserum i 30 min ved stuetemperatur. Vask derefter cellerne tre gange med PBS i 5 min hver.
BEMÆRK: 568 nm Phalloidin kan inkuberes sammen med 488 nm eller 647 nm sekundære antistoffer eller alene. - Inkubere cellerne med 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1000 fortynding) i 250 μL PBS i 10 min efterfulgt af en sidste vask af PBS i 2 min.
- Tilsæt 3-4 dråber monteringsmedium til hver brønd. Prøverne opbevares ved 4 °C for at indstille dem til mindst 2 timer før billeddannelse for at sikre, at monteringsmediet er indstillet korrekt.
- Tag billeder af mindst 3 tilfældige rammer pr. hydrogelprøve med et fluorescensmikroskop, der producerer individuelle og fusionerede kanaler.
4. Kvantitativ PCR i realtid (RT-qPCR)
- Overfør hydrogelerne med klæbecellerne til RNA-indsamling til en ny plade for at minimere uønsket RNA fra celler, der er fastgjort til cellepladen. Vask cellerne med PBS tre gange for at fjerne døde celler og kulturmedium.
- Uddrag det samlede mRNA ved hjælp af et RNA-ekstraktionssæt. Udfør omvendt transskription af RNA til cDNA ved hjælp af en omvendt transskription supermix efter producentens anvisninger.
- Udfør RT-qPCR med primere til Vcl som stivhedsmarkøren, og analysér ved hjælp af 2-ΔΔCT-metoden.
BEMÆRK: Primer sekvens af Vcl: Forward 5'S GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; omvendt 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3«.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hydrogel forberedelse og stivhed vurdering gennem AFM og Hertz model
Her er en detaljeret protokol til at generere polyacrylamid hydrogels af varierende stivhed ved at regulere forholdet mellem acrylamid og bis-acrylamid. Polyacrylamidhydrogelerne er dog ikke klar til vedhæftning af celler på grund af manglen på ECM-proteiner. Sulfo-SANPAH, der fungerer som linker, binder sig således kovalent til hydrogelerne og reagerer med de primære aminer af ECM-proteiner for at gøre det muligt at vedhæfte ECM-proteiner til hydrogelernes overflader via N-hydroxysuccinimid ester i sulfo-SANPAH efter UV-aktivering. Kollagen type jeg blev brugt som ECM protein valg til effektivt at fremme O9-1 celle vedhæftet fil. For at sikre nøjagtige stivhedsværdier for forskellige hydrogeler blev der udført en stivhedsvurdering ved hjælp af AFM, en velkendt teknik til at skildre det elastiske modulus.
Ved vellykket dannelse og fastgørelse af polyacrylamidhydridhydrulat til glasovertrækket forblev gelen klæbende til dæksler med en jævn overflade og minimal rive. Stivheden blev målt ved AFM baseret på indrykningsteknikkens princip, hvori der blev anvendt en stiv indrykning på prøven med den nødvendige kraft til at nå en indrykningsdybde26. Med denne måling, young's elastiske modulus blev beregnet baseret på indrykning af dybde og kraft i Hertz's model, en elastisk teori26. På grund af afM's store variation i resultaterne blev der imidlertid anvendt en yderligere statistisk metode for at opnå et kvantitativt resultat med minimal påvirkning af ujævne overflader og ufuldkommen homogenitet af gelopløsningerne26. For at fremstille en kvantitativ måling ved hjælp af AFM blev der udtaget en samling på mindst 50 kraft- og afstandskurver fra hvert sted på gelprøven for en gennemsnitlig prøvestivhed. Den kraft, der blev anvendt på højstivhedsgelen, var højere end den, der blev anvendt på den blødere gel, hvilket indikerer, at et stivere substrat gav en stejlere hældning i Force vs. Z-grafen, hvor kraft måles i nN, og Z angiver indrykningsdybden mellem indrykningen og prøven.
På bløde hydrogeler var hældningen af den genererede kraftkurve blid, da den nødvendige kraft fra AFM-sonden var mindre (Figur 1A). Men på stive hydrogels, såsom dem med modulus på 40 kPa, den genererede hældning var meget stejlere som den anvendte kraft var højere end for blødere geler (Figur 1B). Efterhånden som adskillelsen mellem sonden og hydrogelprøven falder, øges kurven betydeligt, når spidsen af sonden rører glasdækslerne. Men som adskillelsen afstand stiger, kurven blot nærmer sig 0, da der ikke er nogen anvendt kraft til stede.
Som vist i figur 1Anærmede cantilever på AFM-sonden gelen, angivet af den blå linje, og sonden målte den anvendte kraft, der var nødvendig for at trænge ind i gelprøven og til sidst nå glasdækslet, hvilket forårsagede en pludselig stigning i kraft. På grund af mulige proceduremæssige og instrumentale fejl, såsom kvaliteten af de nødvendige løsninger, varierer den sande stivhed af hydrogelprøver stort set og langt fra den ønskede stivhed. Afm er således et nyttigt værktøj til at validere og bekræfte metoden og samtidig forhindre falsk datapræsentation i yderligere eksperimenter.
I denne AFM-vurdering blev de fem forberedte hydrogelprøver målt ved hjælp af den kvantitative tilgang. Protokollen fokuserede på hydrogel stivhed niveauer på 0,5 kPa, 1 kPa, 10 kPa, 20 kPa, og 40 kPa, som efterligner bredden af biologiske substrat stivhed niveauer rapporteret for differentiering af forskellige celletyper. De kraftkurver, der blev opnået fra AFM-målinger, blev udnyttet til at generere Youngs elastiske modulus i kilopascals ved hjælp af en AFM-analysealgoritmesoftware (Figur 2).
Sammenligning af polyacrylamidhydrogelsystemer og celletyper
Denne tilpasning af den oprindelige protokol af Tse og kolleger giver en effektiv og effektiv tilgang til at studere de mechanosensitive aspekter af NCC ved hjælp af O9-1 celler20. Ændringer af den tidligere protokol omfatter ændring af ECM-proteininkubation: udskiftning af 50 mM HEPES med 0,2% eddikesyre og tilsætning af 10% hesteserum og FBS til cellekultur (trin 1.3.14-1.3.15). Disse ændringer blev valideret ved at sammenligne væksten og vedligeholdelsen af O9-1 NCCs på dette modificerede gelsystem med væksten i den oprindelige (kontrol) protokol. Her dyrkede vi vilde O9-1-celler på begge hydrogelsystemer med det elastiske modul på 1 kPa og 40 kPa for hvert system i basalt medium. Den samlede cellevækststatus og udvikling blev visualiseret ved hjælp af et lyspunktsmikroskop til apoptotiske egenskaber, stresset morfologi og celletilbehør til hydrogelerne. O9-1 celler dyrket på det oprindelige gelsystem resulterede i et højere antal døde celler angivet ved et overskud af runde celler (Figur 3E, F) for både 1 kPa og 40 kPa hydrogeler.
I modsætning hertil udviste O9-1-cellerne, der dyrkes på det modificerede gelsystem, en sund cellevækst og tilstrækkelig tilknytning til hydrogelsubstratet (Figur 3G, H). Desuden blev ncc'ernes forenelighed med det modificerede hydrogelsystem vurderet ved at udføre IF-farvning af NCC-markøren Tcfap2α (AP-2). AP-2 er en transskription faktor udtrykt i NC slægter til at regulere udviklingen i mus embryoner, hvilket gør det egnet til at vurdere kompatibilitet27. Selv om O9-1-celler, der dyrkes på kontrol- og modificerede hydrogelsystemer, begge udtrykte AP-2, var der en signifikant stigning i AP-2-ekspressionen i O9-1-celler, der var forgyldt på det modificerede hydrogelsystem, som angivet ved det stærkere fluorescenssignal og den tilsvarende kvantificering (figur 4A, B).
Derudover blev P19-celler brugt til yderligere at validere fordelene ved det modificerede hydrogelsystem til vækst af celler. P19 er en embryonal karcinom cellelinje, der blev afledt af embryo-afledt teratocarcinom i mus28. Ved hjælp af den tilsvarende kulturprotokol blev P19-celler dyrket på både kontrol- og modificerede hydrogelsystemer for at overvåge overlevelses- og vækstegenskaber. Brightfield imaging afslørede, at P19-celler belagt på begge hydrogelsystemer viste et overskud af runde flydende celler og mangel på cellesubstrat vedhæftede filer (Figur 3A-D). Denne observation antydede, at den ændrede protokol var mere egnet til O9-1 NCCs at studere mekanisk signalering i NCCs.
Visualisering af fiberudtryk med høj stress på stive substrater
Den modificerede hydrogel gav mulighed for kvantitativ og kvalitativ analyse af forskellene i morfologien af celler, der dyrkes på geler med forskellige stivhedsniveauer og andre effektorer. Når hydrogels var klar til celle såning, vilde-type O9-1 celler blev passaget på hydrogels af forskellige stivhed niveauer. Celler blev overvåget for deres helbred og vækst ved at observere deres form, rumlige spredning, og endda vedhæftet fil på hydrogel med minimal døde celler. Nogle undersøgelser har vist en stigning i stressfibre og celle vedhæftning for MSC'er på højstivhedssubstrater, hvilket tyder på, at NPC'er dyrket på et stivere substrat også ville udvise lignende fund sammenlignet med nccs dyrket på blødere substrater29,30.
F-actin sammen med myosin II, α-actinin, og andre cytoskeletale proteiner er kendt kollektivt som stressfibre31. Tidligere undersøgelser observeret en stigning i stress fiber samling som reaktion på øget mekanisk kraft31. I den ene eller begge ender af stressfibrene gør fastgørelser til fokale vedhæftningskomplekset det muligt for celler at migrere og klæbe til ECM31. Phalloidin farvning for at visualisere F-actin udtryk og organisation i NCCs demonstreret sund cellevækst som reaktion på mekanisk signalering (Figur 5). Derudover udstillede O9-1-cellerne, der dyrkes på lav- eller højstivhed hydrogels, forskellige morfologier gennem varierende mængder stressfibre (Figur 5). Svarende til observationer fra rapporterede undersøgelser udført ved hjælp af MSC'er blev det observeret, at O9-1-celler dyrket på et stivere substrat, 40 kPa, udviste flere stressfibre og var godt spredt sammenlignet med celler dyrket på en blødere hydrogel, angivet med 1 kPa stivhed29,30.
Vurdering af celle vedhæftninger
For yderligere at bekræfte hypotesen om, at ændringen i substrat stivhed påvirker NCC vedhæftning, ændringer i Vcl udtryk blev kvantitativt målt via RT-qPCR i NCCs reagerer på forskellige hydrogel stivhed niveauer. Vcl er et af de mange cytoskeletale proteiner, der findes i fokal vedhæsionskomplekset under celleprocessen, der etablerer kontakter med substratet og mærker ECM-egenskaberne32. Fokale vedhæftninger er cellernes kontaktpunkter til ECM via integrinreceptorer, som forankrer til den cytoplasmatiske handling i cytoskeleton, F-actin33 Vcl-genekspressionsniveauet antyder ændringer i fokale vedhæhæftninger og celle vedhæhæftninger af O9-1-cellerne som reaktion på substratets stivhed.
Tidligere undersøgelser viste virkningen af Vcl på celle vedhæftning i embryonale stamceller og fibroblastceller ved forskelle i dens udtryk. Som reaktion på Vcl'shøje udtryk steg antallet og størrelsen af fokale vedhæftninger også , men faldt, da Vcl blev slået ned34. Konsekvent, Vcl-mangelfuldeceller viste også et betydeligt fald i celle vedhæftning og spredning35. Derudover spiller Vcl en rolle i reguleringen af celletilhæftning ved at stabilisere fokale vedhæftninger36. Størrelsen af fokale vedhæftninger, modningsniveau og sammensætninger varierer afhængigt af substratets stivhed, hvilket gør det muligt at transdusere signaler intracellulært og cellerne til at reagere på deres miljømæssige signaler37. Vcl rekrutteres således i høj grad til fokale vedhæftning complexes i celler dyrket på stive substrater, hvilket afspejles af højere mRNA-niveauer opdaget af RT-qPCR (Figur 6C).
Celler, der dyrkes på blødere substrater, danner minimale fokale vedhæftning complexes, som afspejles af lavere mRNA niveauer af Vcl i cellerne15. I figur 6Cudviste O9-1-celler et højere udtryk for Vcl på det stive substrat end på det bløde substrat. Disse resultater tyder på et højere niveau af cellesubstrat vedhæftninger af O9-1 celler på stive substrater end O9-1 celler på blødere substrater. Derudover blev Vcl-udtryk kvalitativt visualiseret gennem IF-farvning med et anti-Vcl-antistof for yderligere at supplere og understøtte RT-qPCR-fundet. Konsekvent var Vcl-udtrykket i O9-1-celler, der dyrkes på det stivere substrat, højere end dem, der dyrkes på det blødere substrat (Figur 6A, B), som yderligere understøttede det første fund af høj celle vedhæftning og spredning på 40 kPa hydrogel sammenlignet med 1 kPa hydrogel observeret med F-actin phalloidin farvning og Vcl udtryksniveauer via RT-qPCR.
Figur 1: Kraftkurver genereret fra indrykningen af AFM-sonden. Kraft (y-akse) angiver den nødvendige kraft, der påføres i nN, og Z (x-akse) angiver Bruker AFM-sondeafstanden fra prøven i μm. For 1 kPa hydrogel(A)er den genererede hældning skånsom i forhold til den stejlere hældning, der observeres for 40 kPa hydrogel (B). De farvede kurver repræsenterer bevægelsen af cantilever på AFM sonden, da den nærmer sig (blå) og trækker sig tilbage (rød) fra hydrogelprøven. Det højeste udgangspunkt for kurven angiver den stive kontakt af glasdækslerne. (B) Den store dukkert i den tilbagetrukne kurve i 40 kPa hydrogel indikerer vedhæftning mellem perlen og prøven. Forkortelse: AFM = atomprøvesprængningsmikroskopi. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Den gennemsnitlige stivhed af hydrogels (i kPa) beregnet ud fra Youngs elastiske modulus. Young's modulus blev genereret fra kraft kurver fra figur 1. Den refererede elastiske moduli af hydrogels var 0,5 kPa, 1 kPa, 10 kPa, 20 kPa og 40 kPa. Fejllinjer angiver standardafvigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Bright-field billeder af P19- og O9-1-celler forgyldt på 1 kPa og 40 kPa hydrogels af kontrol- og modificerede gelsystemer til påvisning af cellevækstegenskaber. døde celler er angivet med røde pile. Skalastænger = 25 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Immunofluorescence farvning af NCC-markør AP-2 i O9-1 NCCs for at visualisere NCC-kompatibilitet. (A) A 40 kPa modificeret hydrogelsystem sammenlignet med (B) en 40 kPa-kontrol. AP-2 (grøn); kerner blev plettet med DAPI (blå). Skalalinjer = 25 μm. (C) Søjlediagram giver kvantificering af AP-2-udtryksniveauet, der viser betydning (p-værdi = 0,003) (n = 3). Data viser det relative udtryk med medfølgende standardafvigelsesfejllinjer. Forkortelser: NCC = neural crest celle; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Fluorescerende phalloidin farvning af F-actin viser stressfibre, der er godt spredt ud i O9-1 celler på 40 kPa hydrogel. O9-1 celler blev dyrket på 1 kPa (A) og 40 kPa hydrogels (B). O9-1 celler blev farves ved hjælp af Alexa Fluor 488 Phalloidin (grøn), og kernerne var plettet med DAPI (blå). Skalastænger = 25 μm. Forkortelse: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Immunofluorescence billeder af vinculin i O9-1 celler. O9-1 celler blev belagt på 1 kPa (A) og 40 kPa (B)hydrogels. Kerner blev plettet med DAPI (blå). Skalabarer = 25 μm. (C) Kvantitativ PCR-analyse i realtid af det samlede mRNA-niveau af Vcl i O9-1-celler, der dyrkes på 1 kPa og 40 kPa hydrogels. Vcl-udtryksniveauet på 1 kPa hydrogel er betydeligt lavere end på 40 kPa hydrogel (p-værdi = 0,02). Data viser gennemsnittet med medfølgende standardafvigelsesfejllinjer. Forkortelse: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. Klik her for at se en større version af dette tal.
| 500 μL samlet volumen | 0,5 kPa | 1 kPa | 10 kPa | 20 kPa | 40 kPa | ||
| 40% Acrylamid (μL) | 37.5 | 62.5 | 125 | 100 | 100 | ||
| 20% Bis-acrylamid (μL) | 15 | 7.5 | 25 | 66 | 120 | ||
| H2O (μL) | 447.5 | 430 | 350 | 334 | 280 | ||
| 10% APS (μL) | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | ||
| TEMED (μL) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | ||
Tabel 1: Tilsvarende mængder opløsninger for at opnå de ønskede stivhedsniveauer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med den nuværende undersøgelse er at skabe et effektivt in vitro-system til bedre at forstå virkningen af mekaniske signaler i NCC'er. Ud over at følge den trin-for-trin protokol, der er nævnt ovenfor, forskere nødt til at huske på, at cellekulturen af O9-1 NCCs er påvirket af den type glas coverslips bruges til at forberede hydrogels. For eksempel blev det bemærket, at celler seedet på en bestemt type glas coverlip (se tabellen over materialer)overlevede og spredte sig godt, mens dyrkede celler sået på andre typer af glas coverslips viste mere celledød. Desuden er det vigtigt nøje at følge de korrekte cellekulturbetingelser for O9-1 NCCs38. Kvaliteten af cellekulturen er optimal, når hydrogelerne anvendes så hurtigt som muligt eller opbevares i en steril 37 °C-inkubator i op til to dage.
På grund af følsomheden af hver komponent i protokollen kan den elastiske moduli variere på tværs af eksperimenter. Ud over de punkter, der er nævnt i protokollen (trin 1.3.2) vedrørende 10% APS, påvirker andre kritiske faktorer, der skal huskes, også variationen. En anden faktor, der var mistænkt for at forårsage store variationer i AFM målinger var tykkelsen af hydrogels. En tidligere undersøgelse havde undersøgt virkningen af tykkelse på Young's moduli, der spænder fra 15 til 1000 μm, og havde konstateret, at forskelle i tykkelse ikke ændre Young's moduli betydeligt39. Tykkelsen af substraterne påvirker dog også de mekaniske egenskaber, som cellerne kan fornemme, hvilket fører til forskellige morfologier40,41,42. Forskellige undersøgelser viste, at en betydelig stigning i tykkelsen af hydrogels førte til et fald i celleområdet, spredning og effektiv stivhed af hydrogels40,41,42. Imidlertid ændres cellefænotyperne også som reaktion på betydeligt tynde hydrogeler, f.eks. højere spredning selv på lavstivhed hydrogels40,41,42. Med en ensartet mængde polyacrylamidgeler skal tykkelsen af hydrogels være ensartet, så små afvigelser ikke vil påvirke den elastiske modulus væsentligt i AFM-målinger.
Det er bedre at sterilisere coverlips ved at passere dem frem og tilbage i flammen ved hjælp af en alkoholbrænder, fordi andre steriliseringsmetoder kan være mere komplicerede og forårsage potentiel skade på glasovertræk. Forskellige størrelser af glasfortræk kan bruges baseret på eksperimentelle krav. Denne protokol udnyttede 12 mm og 25 mm coverslips til henholdsvis immunohistochemistry og RT-qPCR. Brug af passende mellemstore geler, der passer til forsøgene, fremmer effektivitet og minimerer spild. Disse ændringer blev valideret kvalitativt og kvantitativt for at sikre optimering for O9-1 NCCs sammenlignet med det oprindelige (kontrol) hydrogelsystem20. Den generelle sundhed og vækst af O9-1 NCCs blev vurderet under et brightfield mikroskop for cellulære og substrat vedhæftede egenskaber.
Derudover blev kompatibiliteten af O9-1-celler sammenlignet mellem både kontrol og de modificerede hydrogelsystemer for yderligere at validere ændringerne i denne protokol ved kvalitativt at visualisere AP-2-udtrykket ved hjælp af IF-farvning. Intensiteten af signalerne blev kvantificeret for yderligere at understøtte de repræsentative billeder af AP-2 udtryk i O9-1 celler mellem kontrol vs. de modificerede hydrogel systemer. Mens AP-2 er en fælles NCC markør, andre kendte markører skal overvejes til validering, såsom Sox10 og Pax3, på grund af deres betydning for NCC vedligeholdelse af pluripotency og overlevelse28. Derudover blev optimeringen i denne protokol yderligere bekræftet ved at sammenligne O9-1 NC-cellerne med en anden cellelinje, P19, for at sikre, at dette hydrogelsystem er effektivt og pålideligt for NC-celler. Selvom P19-celler har udødelige egenskaber og let dyrkes, trives de ikke godt på nogen af hydrogelsystemerne.
Modstanden mod den aflange kraft genereret fra substratet eller vævsstivhed, hvor cellerne vedhæftes, udtrykkes ofte som Youngs elastiske modulus45. Med AFM opnås Youngs elastiske modulus fra kraftkurven genereret fra den anvendte lodrette kraft26. Der kan forekomme store variationer under AFM-måling mellem målinger, der kan føre til unøjagtige aflæsninger for de stivere hydrogeler. Inkonsekvensen kan skyldes ukorrekte sonder, der anvendes til måling. For eksempel kræver måling af 20 kPa og 40 kPa hydrogels brug af en stivere sonde med en højere fjederkonstant (k = 0,24 N/m). En stivere sonde giver mulighed for en lavere opløsning sammenlignet med en blødere sonde; der er dog grund til at foretrække valget af en stivere sonde, da for bløde cantilevers kan klæbe til prøverne46. Derudover er for bløde sonder meget følsomme, hvilket bidrager til falske signaler fra uønskede partikler og resulterer i kunstigt lavere eller højere stivhedsværdier end den sande stivhed46. Desuden skal der bemærkes nøjagtig tilførsel af Poissons forhold afhængigt af målematerialet. dette kunne findes i standardiserede undersøgelser, da dette i væsentlig grad påvirker dataoutputtet.
Derudover blev AFM brugt til at måle tykkelsen af hydrogels, da tykkelse er en anden mekanisk egenskab, der påvirker, hvordan celler registrerer deres miljø47,42. I forskellige rapporterede undersøgelser observeres celler, der dyrkes på bløde hydrogeler, at være runde i form ved og ud over "kritisk tykkelse", som rapporteres ved ~ 2-5 μm, afhængigt af celletypen47,42,48. Der blev dog observeret meget højere spredning , når cellerne blev forgyldt på hydrogels med samme stivhed, men lavere tykkelse end den "kritiske tykkelse"42,48. En potentiel forklaring på dette interessante fund er, at den subkritiske tykkelse af hydrogels gør det muligt for cellerne at fornemme de stive underliggende glasovertræk, da cellerne udøver trækkraft til sideforskydning47. Den gennemsnitlige tykkelse på tværs af all-stivhed hydrogels var 342 μm med en standardafvigelse på 27 μm. Tykkelsen af hydrogels var højere end den foreslåede "kritiske tykkelse", og inden for testområdet på under 400 μm, som blev rapporteret i undersøgelser og de fremstillede premade hydrogels, således at cellerne kunne fornemme de forskellige stivhed af hydrogels og ikke de underliggende stive glasdræve42,48.
Ud over afM kvantitative analysemetode, hydrogels blev også kvalitativt analyseret gennem immunohistochemistry at studere udtrykket af markører påvirket af den varierende stivhed i O9-1 celler og visualisere sund vækst af cellerne. F-actin i cytoplasmaet er forbundet med de membranbundne integriner via et sæt cytoskeletale proteiner, såsom talin og Vcl, der danner fokal vedhæsionskomplekset33. Ekspression af stressfibre i celler kunne også analyseres ved at måle udtrykket af andre cytoskeletale gener i celler, såsom talin og integrin, som kunne visualiseres sammen ved hjælp af fokal vedhæftningspletten.
Der var varierende grader af hydrogel stivhed, der påvirkede NCC morfologi og respons, som det ses i ændringen i celle vedhæftning og stressfibre gennem mekanisk signalering. Denne protokol giver mulighed for at påvirke celledifferentiering i forskellige celletyper ved at ændre de tilsvarende kulturforhold in vitro, hvilket giver en bekvem metode til manipulation af mekaniske signaler og kemiske signaler i NCCs. Som tidligere nævnt styres NCC-differentieringens skæbne i vid udstrækning af mekaniske kræfter, der er til stede i det omgivende væv, herunder dets stivhed2,3. Mens det umiddelbare mål med dette papir var at udvikle en trinvis protokol til at forberede hydrogels til NCC kultur, de potentielle fordele ved denne protokol strækker sig ud over den metode, der forfølger yderligere viden om mekanisk signalering i NCCs. Det er også værd at bemærke, at dette in vitro-system har nogle begrænsninger. Denne teknik til fremstilling af hydrogeler omfatter flere trin, der potentielt kan indføre tekniske variationer undervejs, herunder heterogenitet, ujævn overflade og unøjagtig stivhed. Derfor skal brugerne udføre disse trin omhyggeligt for at minimere tekniske variationer under eksperimenter. Derudover begrænsede polyacrylamidgeler i dette system undersøgelser til 2D-kultur på grund af acrylamids toksicitet og ignorerede det præcise 3D biologiske miljø, som NCCs befinder sig i50.
På trods af disse begrænsninger giver dette in vitro-system mulighed for en billig og enkel metode til gavn for alle forskningsniveauer og gør det muligt for forskere at udføre tilstrækkelige og funktionelle downstream-tests. Som det ses i de seneste resultater, NCCs er stærkt afhængige af både mekanisk signalering, såsom forskydning kraft og substrat stivhed, og kemisk signalering, såsom Wnt og fibroblast vækstfaktor signalering, i kraniofacial, samt hjerte udvikling ihvirveldyr 6,15. Ved hjælp af denne protokol kan de lokale mikromiljøer til in vitro-eksperimenter let efterlignes til fremtidige undersøgelser af NCC'er, herunder differentiering, migration, cellulære reaktioner og potentialet for skadelig sygdomsprogression. Derfor vil dette in vitro-system være et kraftfuldt værktøj til at studere rollerne af mekanisk signalering i NCCs og deres interaktioner med andre signalveje, hvilket vil uddybe forståelsen af de molekylære og genetiske mekanismer i NCC-udvikling og relaterede sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Ana-Maria Zaske, operatør af Atomic Force Microscope-UT Core facilitet ved University of Texas Health Sciences Center, for den bidrog ekspertise i AFM i dette projekt. Vi takker også finansieringskilderne fra National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 og R01HL142704 til J. Wang).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-012 | |
| 2% Bis-Acrylamide | Sigma Aldrich | M1533 | |
| 24-well plate | Greiner Bio-one | 662165 | |
| 25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-025 | |
| 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | A3648 | |
| 4-well cell culture plate | Thermo Scientific | 179830 | |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | J61899-AP | |
| 40% Acrylamide | Sigma Aldrich | A4058 | |
| 50% glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G7651 | |
| 6-well cell culture plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| AFM cantilever (spherical bead) | Novascan | ||
| AFM software | Catalyst NanoScope | Model: 8.15 SR3R1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher | A12379 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 248614 | Powder |
| anti-AP-2α Antibody | Santa Cruz | sc-12726 | |
| anti-Vinculin antibody | Abcam | ab129002 | |
| Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst | Bruker Corporation | ||
| Collagen type I (100mg) | Corning | 354236 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dichloromethylsilane (DCMS) | Sigma Aldrich | 440272 | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fluorescence microscope | Leica | Model DMi8 | |
| Fluoromount-G mounting medium | SouthernBiotech | 0100-35 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Powder |
| Horse serum | Corning | 35-030-CI | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad | 1708841 | |
| Penicillin-Streptomycin antibiotic | Thermo Fisher | 15140148 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| Sterile 1x PBS | Hyclone | SH30256.02 | |
| Sterile deionized water | Hardy Diagnostics | U284 | |
| sulfo-SANPAH | Thermo Fisher | 22589 | |
| SYBR green | Applied Biosystems | 4472908 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
References
- Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
- Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Developmental Biology. 419 (2), 199-216 (2016).
- Watt, K. E. N., Trainor, P. A. Neurocristopathies: the etiology and pathogenesis of disorders arising from defects in neural crest cell development. Neural Crest Cells-Evolution, Development and Disease. Trainor, P. A. , Academic Press. 361-394 (2014).
- Lavelle, C. L. B. Applied oral physiology. , Butterworth-Heinemann. (1988).
- Chin, L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nature Reviews Cancer. 3 (8), 559-570 (2003).
- Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Wang, Q., et al. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
- Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
- Barriga, E. H., Franze, K., Charras, G., Mayor, R. Tissue stiffening coordinates morphogenesis by triggering collective cell migration in vivo. Nature. 554 (7693), 523-527 (2018).
- Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
- Mason, D. E., et al. YAP and TAZ limit cytoskeletal and focal adhesion maturation to enable persistent cell motility. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1369-1389 (2019).
- Dupont, S., et al.
- Lu, Y. -B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Georges, P. C., Miller, W. J., Meaney, D. F., Sawyer, E. S., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
- Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
- Engler, A., Sweeney, H., Discher, D., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 7 (4), 335 (2007).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. Journal of Cell Science. 121 (22), 3794-3802 (2008).
- Robling, A. G., Turner, C. H. Mechanical signaling for bone modeling and remodeling. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 19 (4), 319-338 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 10, Unit 10.16 (2010).
- Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2089 (2010).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
- Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Varying solvent type modulates collagen coating and stem cell mechanotransduction on hydrogel substrates. APL Bioengineering. 3 (3), 036108 (2019).
- Fedoroff, S., Hall, C. Effect of horse serum on neural cell differentiation in tissue culture. In vitro. 15 (8), 641-648 (1979).
- Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
- Mitchell, P. J., Timmons, P. M., Hébert, J. M., Rigby, P., Tjian, R. Transcription factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mouse embryogenesis. Genes & Development. 5 (1), 105-119 (1991).
- Wegner, M. Neural crest diversification and specification: transcriptional control of Schwann Cell differentiation. Encyclopedia of Neuroscience. , 153-158 (2010).
- Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
- Sun, M., et al. Effects of matrix stiffness on the morphology, adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (3), 257 (2018).
- Burridge, K., Guilluy, C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension. Experimental Cell Research. 343 (1), 14-20 (2016).
- Burridge, K. Focal adhesions: a personal perspective on a half century of progress. The FEBS Journal. 284 (20), 3355-3361 (2017).
- Zhou, C., et al. Compliant substratum modulates vinculin expression in focal adhesion plaques in skeletal cells. International Journal of Oral Science. 11 (2), 1-9 (2019).
- Fernández, J. L. R., Geiger, B., Salomon, D., Ben-Ze'ev, A. Overexpression of vinculin suppresses cell motility in BALB/c 3T3 cells. Cell Motility and the Cytoskeleton. 22 (2), 127-134 (1992).
- Coll, J., et al. Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9161-9165 (1995).
- Saunders, R. M., et al. Role of vinculin in regulating focal adhesion turnover. European Journal of Cell Biology. 85 (6), 487-500 (2006).
- Kuo, J. -C. Focal adhesions function as a mechanosensor. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 126, 55-73 (2014).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58346 (2018).
- Kolewe, K. W., Zhu, J., Mako, N. R., Nonnenmann, S. S., Schiffman, J. D. Bacterial adhesion is affected by the thickness and stiffness of poly (ethylene glycol) hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (3), 2275-2281 (2018).
- Lin, Y. -C., et al.
- Mullen, C. A., Vaughan, T. J., Billiar, K. L., McNamara, L. M. The effect of substrate stiffness, thickness, and cross-linking density on osteogenic cell behavior. Biophysical Journal. 108 (7), 1604-1612 (2015).
- Tusan, C. G., et al. Collective cell behavior in mechanosensing of substrate thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
- McBurney, M. W., Jones-Villeneuve, E. M., Edwards, M. K., Anderson, P. J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature. 299 (5879), 165-167 (1982).
- Hasegawa, A., Shirayoshi, Y. P19 cells overexpressing Lhx1 differentiate into the definitive endoderm by recapitulating an embryonic developmental pathway. Yonago Acta Medica. 58 (1), 15 (2015).
- Wells, R. G.
- Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
- Butler, J. P., Tolic-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Leong, W. S., et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (2), 287-292 (2010).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Funaki, M., Janmey, P. A. Technologies to engineer cell substrate mechanics in hydrogels. Biology and Engineering of Stem Cell Niches. , Academic Press. 363-373 (2017).
