Expériences de RMN à haute pression pour détecter les états conformationnels bas des protéines
Summary
Nous fournissons une description détaillée des étapes nécessaires à l’assemblage d’une cellule haute pression, à la mise en place et à l’enregistrement d’expériences de RMN à haute pression, et enfin à l’analyse des changements d’intensité maximale et de décalage chimique sous pression. Ces expériences peuvent fournir des informations précieuses sur les voies de repliement et la stabilité structurelle des protéines.
Abstract
La haute pression est une méthode de perturbation bien connue qui peut être utilisée pour déstabiliser les protéines globulaires et dissocier les complexes protéiques de manière réversible. La pression hydrostatique entraîne des équilibres thermodynamiques vers le(s) état(s) avec le volume molaire inférieur. L’augmentation de la pression offre donc la possibilité d’ajuster finement la stabilité des protéines globulaires et les équilibres d’oligomérisation des complexes protéiques. Les expériences de RMN à haute pression permettent une caractérisation détaillée des facteurs régissant la stabilité des protéines globulaires, leurs mécanismes de repliement et leurs mécanismes d’oligomérisation en combinant la capacité de réglage fin de la stabilité de la perturbation de la pression et la résolution du site offerte par la spectroscopie RMN en solution. Nous présentons ici un protocole pour sonder la stabilité de repliement local d’une protéine via un ensemble d’expériences 2D 1H-15N enregistrées de 1 bar à 2,5 kbar. Les étapes requises pour l’acquisition et l’analyse de telles expériences sont illustrées par les données acquises sur le domaine RRM2 de hnRNPA1.
Introduction
Il est reconnu depuis longtemps que les états conformationnels de protéines et de complexes protéiques à haute énergie et peu peuplés jouent un rôle clé dans de nombreuses voies biologiques1,2,3. Grâce à des expériences basées sur carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4,Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5et DEST(SDET)6 séquences d’impulsions (entre autres), la spectroscopie RMN en solution est apparue comme une méthode de choix pour caractériser les états conformationnels transitoires7. Parallèlement à ces expériences, des perturbations telles que la température, le pH ou les dénaturants chimiques peuvent être introduites pour augmenter la population relative de sous-états conformationnels d’énergie plus élevée. De même, les équilibres protéiques peuvent également être perturbés par l’application d’une pression hydrostatique élevée. Selon l’ampleur du changement de volume associé aux changements conformationnels correspondants, une augmentation de pression de quelques centaines à quelques milliers de bars peut stabiliser de manière significative un état d’énergie plus élevé ou provoquer le déploiement complet d’une protéine8,9,10. Les spectres rmN des protéines présentent généralement deux types de changements avec la pression hydrostatique: (i) les changements de décalage chimique et (ii) les changements d’intensité de pointe. Les changements de décalage chimique reflètent les changements à l’interface protéine-eau de surface et/ou la compression locale de la structure protéique sur une échelle de temps rapide (par rapport à l’échelle de temps RMN)11. Les croisements présentant une grande dépendance de pression de décalage chimique non linéaire peuvent indiquer la présence d’états conformationnels d’énergie plus élevés12,13. D’autre part, les changements d’intensité maximale indiquent des transitions conformationnelles majeures sur une échelle de temps lente, telles que des changements dans les populations d’États repliés / dépliés. La présence d’intermédiaires de repliement ou d’états d’énergie plus élevés peut être détectée à partir de grandes variations de l’ampleur du changement de volume lors du dépliage mesurée pour différents résidusd’uneprotéine donnée14,15,16,17. D’après notre expérience, même les petites protéines qui sont généralement classées comme des dossiers à deux états présentent des réponses non uniformes à la pression, ce qui fournit des informations utiles sur leur stabilité de repliement local. Décrit ici est un protocole pour l’acquisition et l’analyse de l’intensité maximale de l’amideet de la dépendance à la pression des changements chimiques 1 H, en utilisant comme protéine modèle le motif de reconnaissance d’ARN isolé 2 (RRM2) de la ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène A1 (hnRNPA1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette étude détaille un protocole mis en œuvre pour sonder les réponses structurelles et thermodynamiques des protéines à la perturbation de la pression. Les expériences à haute pression enregistrées ici sur RRM2 démontrent que de grandes variations dans les valeurs ΔVU, révélatrices d’un déploiement non entièrement coopératif, peuvent être trouvées dans une protéine relativement petite à domaine unique. Une image similaire se dégage de l’analyse des changements de décalage chimique <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des fonds du Roy J. Carver Charitable Trust à Julien Roche. Nous remercions J. D. Levengood et B. S. Tolbert d’avoir aimablement fourni l’échantillon RRM2.
Materials
| Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar | Daedalus Innovations LLC | NMRCELL-B | |
| Sparky3 | University of California San Francisco, CA | N/A | |
| Xtreme-60 Syringe pump | Daedalus Innovations LLC | XTREME-60 |
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