단백질 저거짓말 형성 상태를 검출하기 위한 고압 NMR 실험
Summary
우리는 고압 세포를 조립하고, 고압 NMR 실험을 설정하고 기록하고, 마지막으로 압력하에서 피크 강도 와 화학 적 변화 변화를 모두 분석하는 데 필요한 단계에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 실험은 단백질의 접이식 통로 및 구조적인 안정성에 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
Abstract
고압은 구형 단백질을 불안정하게 하고 단백질 복합체를 가역적 방식으로 해리시키는 데 사용할 수 있는 잘 알려진 교란 방법입니다. 유압은 낮은 어금니 볼륨을 가진 주쪽으로 열역학 평형을 구동합니다. 증가하는 압력은, 그러므로, 구형 단백질의 안정성및 단백질 복합체의 올리고머화 평형을 미세하게 조정할 수 있는 기회를 제공합니다. 고압 NMR 실험은 압력 변투의 미세한 안정성 튜닝 능력과 솔루션 NMR 분광법에 의해 제공되는 사이트 해상도를 결합하여 구형 단백질의 안정성, 접이식 메커니즘 및 올리고머화 메커니즘의 안정성을 관장하는 요인의 상세한 특성화를 허용합니다. 여기서 우리는 1 bar에서 2.5 kbar로 기록된 2D 1H-15N 실험세트를 통해 단백질의 국소 접이식 안정성을 조사하는 프로토콜을 제시한다. 이러한 실험의 수집 및 분석에 필요한 단계는 hnRNPA1의 RRM2 도메인에서 획득한 데이터와 함께 설명됩니다.
Introduction
단백질과 단백질 복합체의 고에너지, 인구밀도가 낮은 형태가 많은 생물학적경로1,2,3에서중요한 역할을 한다는 것은 오랫동안 인식되어 왔다. 카-퍼셀-메이붐-길(CPMG)4,화학교류 포화전달(CEST)5,암흑상태 교환 포화전달(DEST)6 펄스 서열(그 외) 등) 실험덕분에, 용액 NMR 분광법은 일시적인 축축상태를 특성화하기 위한 선택의 방법으로등장했다. 이러한 실험과 함께, 온도, pH 또는 화학 적 강수제와 같은 교란은 더 높은 에너지 형성 하위 상태의 상대적 인구를 증가시키기 위해 도입 될 수있다. 마찬가지로, 단백질 평형증은 또한 높은 정압을 적용하여 혼란을 수 있습니다. 해당 형태 변화와 관련된 부피 변화의 크기에 따라, 수백~몇 천 개의 바의 압력 증가는 더 높은 에너지 상태를 현저하게 안정화하거나 단백질이8,9,10으로완전히 전개될 수 있다. 단백질 NMR 스펙트럼은 일반적으로 정수 압력으로 두 가지 유형의 변화를 표시합니다: (i) 화학 적 변화 변화와 (ii) 피크 강도 변화. 화학적 변화 변화는 단백질 표면-물 인터페이스 및/또는 단백질 구조의 국소 압축에서의 변화를 빠른 시간 척도(NMR 시간 척도에 비해)11로반영한다. 큰 비선형 화학적 변속 압력 의존성을 나타내는 크로스피크는12,13의높은 에너지 형성 상태의 존재를 나타낼 수 있다. 반면에, 피크 강도 변화는 접힌 상태 집단의 변화와 같은 느린 시간 척도의 주요 형태 전환을 가리킵니다. 접이식 중간체 이상의 에너지 상태의 존재는 주어진 단백질14,15,16,17의상이한 잔류물을 측정하여 전개시 부피 변화의 크기가 큰 변화로부터 검출될 수 있다. 우리의 경험을 바탕으로, 일반적으로 2 상태 폴더로 분류되는 작은 단백질조차도 압력에 대한 균일하지 않은 반응을 나타내며, 이는 현지 접이식 안정성에 대한 유용한 정보를 제공합니다. 여기에 설명된 아미드 피크 강도및 1H화학적 변화 압력 의존성의 수집 및 분석을 위한 프로토콜이, 모델 단백질로서 이질적인 핵 리보뉴클레오프로틴 A1(hnRNPA1)의 절연 RNA 인식 모티프 2(RRM2)를 사용하는 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구는 압력 동요에 대한 단백질 구조 및 열역학 반응을 조사하기 위해 구현된 프로토콜을 자세히 설명합니다. RRM2에 기록된 고압 실험은 비완전 협동 전개를 나타내는 ΔVU 값의 큰 변화가 상대적으로 작은 단일 도메인 단백질에서 발견될 수 있음을 보여준다. 압력하에서 1H화학 적 변화 변화의 분석에서 유사한 그림이 나타난다. 칼비처와 동료들은 화학적 시프트 변화에 대한 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 로이 J. 카버 자선 신탁에서 줄리앙 로슈에 이르는 기금으로 지원되었습니다. 우리는 친절하게 RRM2 샘플을 제공 J. D. 레벤트와 B. S. 톨버트 감사합니다.
Materials
| Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar | Daedalus Innovations LLC | NMRCELL-B | |
| Sparky3 | University of California San Francisco, CA | N/A | |
| Xtreme-60 Syringe pump | Daedalus Innovations LLC | XTREME-60 |
References
- Alderson, R. T., Kay, L. E. Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).
- Korzhnev, D. M., Kay, L. E. probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding. Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).
- Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. D. Characterization of enzyme motions by solution NMR relaxation dispersion. Accounts of Chemical Research. 41, 214-221 (2008).
- Ishima, R. CPMG relaxation dispersion. Methods in Molecular Biology. 1084, 29-49 (2014).
- Longo, D. L., et al. Chemical exchange saturation transfer (CEST): an efficient tool for detecting molecular information on proteins’ behaviour. Analyst. 39, 2687-2690 (2014).
- Fawzi, N. L., Ying, J., Torchia, D. A., Clore, M. G. Probing exchange kinetics and atomic resolution dynamics in high-molecular-weight complexes using dark-state exchange saturation transfer NMR spectroscopy. Nature Protocols. 7, 1523-1533 (2012).
- Anthis, N. J., Clore, M. G. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).
- Roche, J., et al. Cavities determine the pressure unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).
- Chen, C. R., Makhatadze, G. I. Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability. Nature Communications. 8, 14561 (2017).
- Roche, J., Royer, C. A. Lessons from pressure denaturation of proteins. Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244 (2018).
- Xu, X., Gagné, D., Aramini, J. M., Gardner, K. H. Volume and compressibility differences between protein conformations revealed by high-pressure NMR. Biophysical Journal. 120, 924-935 (2021).
- Akasaka, K., Li, H. Low-lying excited states of proteins revealed from non-linear pressure shifts in 1H and 15N NMR. 생화학. 40, 8665-8671 (2001).
- Akasaka, K. Probing conformational fluctuation of proteins by pressure perturbation. Chemical Reviews. 106, 1814-1835 (2006).
- Kitahara, R., Yokoyama, S., Akasaka, K. NMR snapshots of a fluctuating protein structure: ubiquitin at 30 bar-3 kbar. Journal of Molecular Biology. 347, 277-285 (2005).
- Roche, J., et al. remodeling of the folding free energy landscape of Staphylococcal nuclease by cavity-creating mutations. 생화학. 51, 9535-9546 (2012).
- Nucci, N. V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).
- Maeno, A., et al. Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme. Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).
- Peterson, R. W., Wand, J. A. Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 76, 094101 (2005).
- Goddard, T. D., Kneller, D. G. . Sparky 3. , (2010).
- Caro, J. A., Wand, J. A. Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology. Methods. 148, 67-80 (2018).
- Kitamura, T., Itoh, J. Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH. Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).
- Royer, C. A. Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding. Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).
- Erlach, M. B., et al. Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters. Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).
- de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).
- Nguyen, L. M., Roche, J. High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation. Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).
