Vi ger en detaljerad beskrivning av de steg som krävs för att montera en högtryckscell, ställa in och registrera NMR-experiment med högt tryck och slutligen analysera både toppintensitet och kemiska skiftförändringar under tryck. Dessa experiment kan ge värdefulla insikter om proteinens vikningsvägar och strukturella stabilitet.
Högt tryck är en välkänd störmetod som kan användas för att destabilisera klotformiga proteiner och dissociera proteinkomplex på ett reversibelt sätt. Hydrostatiskt tryck driver termodynamisk jämvikt mot tillstånden med den nedre molära volymen. Att öka trycket erbjuder därför möjligheterna att finjustera stabiliteten hos klotformiga proteiner och oligomeriseringsjämvikten hos proteinkomplex. Nmr-experiment med högt tryck möjliggör en detaljerad karakterisering av de faktorer som styr stabiliteten hos klotformiga proteiner, deras vikmekanismer och oligomeriseringsmekanismer genom att kombinera den finstabilitetsjusteringsförmågan hos tryckstörning och den platsupplösning som erbjuds av lösning NMR-spektroskopi. Här presenterar vi ett protokoll för att undersöka den lokala vikningsstabiliteten hos ett protein via en uppsättning 2D 1H-15N-experiment inspelade från 1 bar till 2,5 kbar. De steg som krävs för förvärv och analys av sådana experiment illustreras med data som förvärvats på RRM2-domänen hnRNPA1.
Det har länge erkänts att glesbefolkade konformations tillstånd av proteiner och proteinkomplex spelar en nyckelroll i många biologiska vägar1,2,3. Tack vare experiment baserade på Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4,Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5, och mörkstatsväxlingsmättnadsöverföring (DEST)6 pulssekvenser (bland andra), har lösning NMR-spektroskopi dykt upp som en metod för att karakterisera övergående konformationstillstånd7. Tillsammans med dessa experiment kan reaktioner som temperatur, pH eller kemiska denatureringsmedel införas för att öka den relativa populationen av högre energikonformationsunderstater. På samma sätt kan proteinjämvikt också störs genom att applicera högt hydrostatiskt tryck. Beroende på storleken på volymförändringen i samband med motsvarande konformationsförändringar kan en ökning av trycket med några hundra till några tusen staplar avsevärt stabilisera ett högre energitillstånd eller orsaka att ett protein helt utvecklas8,9,10. Protein NMR-spektra uppvisar vanligtvis två typer av förändringar med hydrostatiskt tryck: (i) kemiska skiftförändringar och (ii) högsta intensitetsförändringar. Förändringar i kemiskt skifte återspeglar förändringar vid proteinets ytvattengränssnitt och/eller lokal kompression av proteinstrukturen på en snabb tidsskala (i förhållande till NMR-tidsskalan)11. Crosspeaks som uppvisar stora icke-linjära kemiska skiftningar tryckberoende kan indikera förekomsten av högre energikonformations tillstånd12,13. Å andra sidan pekar toppintensitetsförändringar på stora konformationsövergångar på en långsam tidsskala, till exempel förändringar i vikta/utfällda tillståndspopulationer. Förekomsten av vikbara intermediärer eller högre energilägen kan detekteras från stora variationer i volymförändringens storlek vid utfällning mätt för olika rester av ett givet protein14,15,16,17. Baserat på vår erfarenhet uppvisar även små proteiner som vanligtvis klassificeras som tvåstatsmappar icke-enhetliga svar på tryck, vilket ger användbar information om deras lokala vikstabilitet. Beskrivs här är ett protokoll för förvärv och analys av amide topp intensitet och 1H kemikalie skiftar tryckberoende, med hjälp av som modellprotein det isolerade RNA erkännande motivet 2 (RRM2) av heterogeneous kärn- ribonucleoprotein A1 (hnRNPA1).
Denna studie beskriver ett protokoll som genomförts för att sondera protein strukturella och termodynamik svar på tryck stör. De högtrycksexperiment som registrerats här på RRM2 visar att stora variationer i ΔV U-värden, som tyder på icke-helt kooperativ utveckling, finns i ett relativt litet endomänprotein. En liknande bild framträder från analysen av 1H kemiska skiftförändringar under tryck. Det bör noteras att Kalbitzer och medarbetare har visat att en mer djupgående analys av f?…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av medel från Roy J. Carver Charitable Trust till Julien Roche. Vi tackar J.D. Levengood och B. S. Tolbert för att de vänligen tillhandahåller RRM2-provet.
Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar | Daedalus Innovations LLC | NMRCELL-B | |
Sparky3 | University of California San Francisco, CA | N/A | |
Xtreme-60 Syringe pump | Daedalus Innovations LLC | XTREME-60 |