우리는 뉴런 핵세포질 수송의 고함량 자동 분석을 위해 일차 마우스 피질 뉴런의 선택적 원형질막 투과화에 대한 신뢰할 수 있는 방법을 개발했습니다.
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우리는 뉴런 핵세포질 수송의 고함량 자동 분석을 위해 일차 마우스 피질 뉴런의 선택적 원형질막 투과화에 대한 신뢰할 수 있는 방법을 개발했습니다.
핵세포질 수송의 중단은 신경퇴행성 질환의 발병기전과 점점 더 관련이 있습니다. 더욱이, 핵공극 복합체 구조에서 세포 특이적 차이에 대한 인식이 높아지고 있어 뉴런에 사용하기 위해 핵 수송 방법을 조정해야 할 필요성이 대두되고 있습니다. 원형질막을 디지토닌(digitonin)에 의해 선택적으로 천공하는 투과화된 세포 분석법은 불멸화된 세포주에서 수동 및 능동 핵 수송을 연구하는 데 널리 사용되지만 신경 세포 배양에는 적용되지 않았습니다. 초기 시도에서 우리는 낮은 농도의 디지토닌에 노출된 1차 마우스 피질 뉴런에서 핵막 무결성의 급격한 손실을 관찰했습니다. 우리는 뉴런 핵막이 세포질 지지의 손실에 유일하게 취약할 수 있다는 가설을 세웠습니다. 핵 안정성을 개선하기 위한 여러 접근법을 테스트한 후, 농축된 소 혈청 알부민 쿠션이 있는 상태에서 저장성 용해 후 최적의 핵 무결성을 관찰했습니다. 이 접근법에 의해 준비된 신경 세포핵은 에너지 의존적 방식으로 재조합 형광 화물을 안정적으로 수입하여 자동 분석을 통한 고함량 현미경 검사로 핵 수입 분석을 용이하게 합니다. 우리는 이 방법이 1차 뉴런의 수동 및 능동 핵 수송 연구에 광범위하게 적용될 것으로 예상합니다.
핵세포질 수송(nucleocytoplasmic transport)의 중단, 즉 핵과 세포질 사이의 단백질과 RNA의 조절된 이동은 신경퇴행성 질환의 발병기전과 점점 더 관련이 있습니다(최근 검토1). 본 연구진을 비롯한 연구자들은 C9orf72 근위축성 측삭 경화증(ALS) 및 전두측두엽 치매(FTD), 알츠하이머병, 헌팅턴병의 사후 조직 및 동물 모델에서 핵세포질 수송 장치의 구조적 및 기능적 장애를 보고했다 2,3,4,5. 신경퇴행에 대한 핵세포질 수송 중단의 메커니즘과 기능적 결과, 그리고 치료적 구조를 위한 접근 방식은 지속적인 연구가 진행 중인 영역입니다.
핵공은 ~30개의 뉴클레오포린 단백질로 구성된 큰 막관통 복합체로, 핵막을 가로질러 작은 분자의 확산을 허용하지만 중앙 채널에서 페닐알라닌-글리신(FG)이 풍부한 뉴클레오포린의 투과성 장벽을 통해 >40kD의 화물 통과를 점점 더 제한합....
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먼저, 프로토콜은 1차 신경 세포 배양(1단계) 및 수송 분석을 위한 물질 준비(2단계)를 설명한 다음, 수송 분석 자체(3-4단계)와 이미지 획득 및 분석(5단계)을 설명합니다. 여기에 설명된 모든 방법은 존스 홉킨스 대학의 동물 관리 및 사용 위원회(ACUC)의 승인을 받았습니다.
1. 1차 마우스 피질 뉴런 배양
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원형질막의 선택적 투과화(그림 1A)는 프로토콜에서 가장 중요한 단계이며 핵 수입 분석을 진행하기 전에 검증해야 합니다. 각 배양 준비 간의 차이로 인해 3단계에서 설명한 대로 저장성 Tris-HCl 완충액 및 BSA 쿠션의 최적 배치 특이적 농도를 식별하기 위해 초기 적정 플레이트가 일상적으로 실행됩니다. 과소 투과 및 과투과 세포는 70kD dextran이 세포질 구획으로 침투하지 못하거나 세포질 및 핵 구획 내에 각각 dextran이 존재하기 때문에 컨포칼 현미경(그림 1B)으로 쉽게 식별할 수 있습니다. 최적의 조건에서 대다수의 세포(≥80%)는 핵막을 둘러싸고 있지만 교차하지 않는 70kD 덱스트란을 보여줍니다.
투과성 최적화에 이어 4단계에서 설명한 다음 중요한 단계는 형광 화물의 핵 수입이 에너지 및 수송 수용체에 의존한다는 것을 확인하는 것입니다(
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위에서 자세히 설명한 프로토콜은 핵 가져오기 분석을 위해 1차 마우스 피질 뉴런의 원형질막을 선택적으로 투과화하기 위한 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법을 제공합니다. 여기에서는 직접 수입 β 화물(Rango)의 핵 수입 분석 방법의 응용 프로그램을 보여주지만, 이와 동일한 접근 방식을 사용하여 광범위한 형광 화물의 수동 및 능동 수입을 분석할 수 있습니다. 투과화는 ALS 및 FTD14와 관련된 돌연변이 C9orf72 디펩타이드 반복 단백질(DPR)에 대해 최근에 설명한 것처럼 온전한 세포에서는 실현 가능하지 않은 방식으로 수송 반응을 정밀하게 조작할 수 있습니다. 합성 DPR 단백질은 핵 수입 반응이 시작되기 전에 수송 용해물로 사전 배양되어 아르기닌 함유 DPR에 의한 핵 수입 차단의 농도 및 길이 의존성 분석을 용이하게 했습니다. 분획 연구에서는 핵 수입에 대한 기능적 결과를 분석하기 위해 DPR 유도 .......
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