직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBEM)는 뮤린 해마의 수지상 척추를 이미지 및 분석하기 위해 적용된다.
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이 논문에서
요약
초록
3차원 전자 현미경 검사법(3D EM)은 나노 스케일 분해능을 사용하여 수지상 척추의 형태학적 파라미터를 분석할 수 있는 가능성을 제공합니다. 또한, 척추 및 시냅스 후 밀도(PSD)의 부피(시냅스 후 부분, 시냅스 후 부분), 프리시냅틱 단말의 존재, 부드러운 내시경 망상 또는 비정형 형태의 PSD(예를 들어, 다중 내압 스핀)와 같은 수지상 척추의 일부 특징은 EM3D로만 관찰될 수 있다. 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBEM)를 채용함으로써 기존의 직렬 단면을 수행할 때보다 3D EM 데이터를 보다 쉽고 재현 가능한 방식으로 얻을 수 있다. 여기서 우리는 SBEM 분석을 위한 마우스 해마 견본을 준비하는 방법 및 이 프로토콜이 수지상 척추의 면역 형광 연구 결과와 어떻게 결합될 수 있는지 보여줍니다. 온화한 고정 관류는 우리가 두뇌의 반에 가벼운 현미경 검사법을 가진 면역 형광 연구를 능력을 발휘할 수 있게 하고, 나머지 반은 SBEM을 위해 준비되었습니다. 이 접근은 연구 결과에 사용될 동물의 수를 감소시킵니다.
서론
중추 신경계의 흥분 시냅스의 대부분은 수지상 척추에 위치합니다 - 신경 막의 작은 돌출. 이러한 돌출은 세포내 신호 변환을 제어하는 제한된 생화학 적 구획을 형성합니다. 수지상 척추 및 시냅스의 구조적 가소성은 학습 및 메모리1,2와 같은 중요한 과정의 기초가 되는 시냅스 효능의 기능적 변화와 밀접한 관련이있다. 전자 현미경 검사법(EM)은 수지상 척추에 사전 시냅스 입력이 있는지 확인할 수 있는 유일한 기술입니다. EM 해상도는 또한 시냅스의 포스트냅스 부분 또는 수지상 척추의 치수를 나타내는 포스트 냅스 밀도(PSD)의 모양과 같은 초구조적 세부 사항뿐만 아니라 축삭 부톤의 크기와 모양을 연구하는 데 필요합니다. 또한 EM을 사용하면 시냅스와 주변 환경을 시각화할 수 있습니다.
이미징 및 컴퓨팅 기술의 발전 덕분에 전체 신경 회로를 재구성할 수 있습니다. 직렬 단면 투과 전자 현미경 검사법(ssTEM), 직렬 블록-페이스 스캐닝 전자 현미경검사(SBEM), 및 집중이온 빔 스캐닝 전자 현미경검사법(FIB-SEM)과 같은 부피 전자 현미경 기술은 일반적으로 뉴런 회로 재구성3에사용된다.
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프로토콜
이 연구는 Nencki 연구소 지침 및 지역 윤리위원회의 허가에 따라 수행되었습니다. 이 연구는 1986년 11월 24일 유럽 공동체 협의회 지침(86/609/EEC), 폴란드 동물 보호법 및 바르샤바 최초의 지역 윤리 위원회의 승인을 받아 수행되었습니다. 사용된 동물의 수와 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.
주의: 아래에 설명된 모든 절차는 실험실 연기 후드에서 수행해야 합니다. 사용 된 시약의 위험 특성으로 인해. 장갑, 실험실 코트, 안전 안경 및 얼굴 마스크와 같은 개인 안전 조치가 필요합니다.
1. 관류고정 제제 (2 % wt / vol para포름알데히드 (PFA) 및 0.5 % vol/vol 글루타랄데히드 (GA) 0.1 M 인산염 버퍼 (PB), pH 7.4)
참고: 고정 솔루션을 사용하는 것과 같은 날에 준비하고 3시간 이상 보관하지 않습니다. 시간 부족의 경우, 전날 0.1 M PB로 2 % PFA를 준비하고 4 ° C에 저장하고 관류 직전에 신선한 GA를 추가하십시오.
- 멸균 이중 증류수(ddH2O)의400mL를 넣고 교반 핫 플레이트를 사용하여 60°C로 가열합니다. 그런....
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결과
상기 높은 대비를 기재한 방법을 이용하여 마우스 뇌 조직의 좋은 해상도 이미지를 얻을 수 있다. SBEM 기술이 제공하는 넓은 시야는 관심 영역을 정확하게 선택할 수 있도록 합니다. 해마의 CA1 영역의 큰 이미지는 층 라디툼(SR)(도 2A)의 길이를 측정하고, 중앙(도2B)에서정밀하게 이미징을 설정하도록 촬영하였다. 다음으로, 이미지의 스택을 획득하고 점선, 수지상 척추, 시냅스의 포스트 냅스 밀도와 같은 관심있는 개체가 분할되었다(도2C,D).
SBEM 기술의 사용은 비교적 많은 양의 조직을 분석하고 다중 내적 수지상척추(그림 2E)와같은 희귀 한 사건을 인식 할 수있는 가능성을 제공합니다 - 동일한 포스트 냅틱 척.......
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토론
2010 년10에서Deerinck에 의해 설명 된 기본 NCMIR 방법의 많은 변형이 있습니다. 기본 원칙은 동일하게 유지되지만 연구된 자료유형에 따라 약간의 변화가 구현됩니다. 이전에는 상이한 수지가 SBEM용 시편을 포함시키는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어 식물의 경우, Spurr's는세포벽(22,23)을통해 더 나은 침투를 허용하는 낮은 점도로 인해 선택의 수지이다. 더욱이, 다양한 완충액은 고정(예를 들어, 카코딜레이트 완충, HEPES, 또는 인산염 완충제뿐만 아니라 글루타랄데히드(2-3%) 및 파라포름알데히드(2-4%)23,24,25,26,<.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
SBEM 이미징, 가벼운 현미경 이미징 및 전자 현미경 샘플 제제는 Ncki 실험 생물학 연구소의 이미징 코어 시설로 작용하는 이미징 조직 및 기능 실험실의 장비를 사용하여 수행되었습니다.
도 1의 준비를 위해, 마우스(Souris_02)의 이미지와 https://smart.servier.com/ 바이알이 사용되었다.
이 작품은 국립 과학 센터 (폴란드) 그랜트 오푸스 (UMO-2018/31/B /NZ4/01603)에 의해 지원되었다 KR에 수여.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 마취제 : < / strong> | |||
| Ketamine / xylazine mixture (Ketamina / Sedazin) | Biowet Pulawy, Pulawy, Poland | ||
| 나트륨 펜토 바르비탈 (Morbital) | Biowet Pulawy, Pulawy, Poland | ||
| Fixatives : < / strong> | |||
| Glutaraldehyde (GA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | G5882 | Grade I, H2O에서 25%, 전자 현미경 고정식 |
| 염산(HCl) | POCH, Gliwice, Poland | 575283115 | pure p.a. |
| 파라포름알데히드(PFA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | 441244 | prilled, 95% |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | P4417-50TAB | 정제 |
| 수산화나트륨(NaOH) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | S5881 | 시약 등급,  98%, 펠릿( 무수) |
| 인산나트륨 이염기성(Na2HPO4) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | S3264 | |
| 인산나트륨 일염기성(NaH2PO4) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | S3139 | |
| perfusion: | |||
| Large blunt/blunt curved 가위(~14.5cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14519-14 | |
| Micro-spatula (이중 2" 플랫 엔드, 1개는 둥근, 하나는 1/8로 테이퍼링) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 10091-12 | |
| 바늘 끝, 15 GA, 무딘(관류 바늘) | KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Germany | KD-FINE 900413 | 1.80 x 40 mm |
| 파인(Graefe) 핀셋 | 쌍Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 11050-10 | |
| 관류 펌프 | 납 유체 | BQ80S | |
| 플라스틱 바이알 | Profilab, 바르샤바, 폴란드 | 534.02 | 조직 보관용 파란색 캡이 있는 플라스틱 바이알, 20ml, 31 x 48mm |
| 스트레이트 아이리스 가위(~9cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14058-11 | |
| Brain slices EM 준비: strong> | |||
| 12-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 712001 | |
| 시아노아크릴 접착제 | Fenedur, Montevideo, Uruguay | ||
| Glass vials | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72632 | 20 ml 섬광 바이알, 100 |
| 파스퇴르 피펫 | VWR, Radnor, PA, USA | 612-4545 | LDPE, 일회용, 7.5 ml |
| 면도날 | Wilkinson Sword, 런던, 영국 | 클래식 양날 안전 면도날 | |
| 스 블레이드 | Swann-Morton, Sheffield, UK | No. 20 | |
| Vibratome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica VT1000 S | |
| Brain slices preparation for IF: | |||
| 96-well plate | NEST, Rahway, NJ, 미국 | 701101 | |
| Criostat | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica CM 1950 | |
| Ethylene glycol | Bioshop, Burlington, Canada | ETH001 | |
| 로우 프로파일 일회용 블레이드 819 | Leica Biosystems Inc., USA | 14035838925 | |
| 메스 블레이드 | Swann-Morton, Sheffield, UK | No. 20 | |
| 아지드화나트륨(NaN3) | POCH, Gliwice, Poland | 792770426 | |
| Sucrose | POCH, Gliwice, Poland | 772090110 | |
| Tissue freezing medium for cryosectioning, OCT-Compound | Leica Biosystems, 스위스 | 14020108926 | |
| Immunostaining: | |||
| 24-well plate | NEST, Rahway, NJ, 미국 | 702001 | |
| Anti-Post Synaptic Density Protein 95 항체 | Merck-Millipore, Burlington, MA, USA | MAB1598 | |
| 컨포칼 현미경 | Zeiss, Gö ttingen, 독일 | Zeiss Spinning Disc microscope (63 × oil objective, NA 1.4, pixel size 0.13 µ m &시간; 0.13 &마이크로; m) | |
| 커버 슬라이드 | Menzel Glaser, Braunschweig, Germany | B-1231 | 24 x 60 mm |
| 당나귀 안티 마우스 IgG (H+L) 고도로 교차 흡착된 2차 항체, Alexa Fluor 555 | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | A31570 | |
| Fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | 00-4959-52 | |
| Microscope slide | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | AGAA00008 | SuperFrost |
| Normal 당나귀 혈청 (NDS) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| Shaker | JWElectronic, Warsaw, Poland | KL-942 | |
| TritonT X-100 Reagent Grade | Bioshop, Burlington, Canada | TRX506 | |
| Electron microsocpy sample preparation | |||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | POCH, Gliwice, Poland | 746980113 | |
| Aclar 33C Film | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 50425 | 불소 중합체 필름 임베딩 시트 |
| DMP-30, 2,4,6-Tris (dimethylaminomethyl) phenol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | T58203 | 에폭시 매립 매체 가속기 |
| Durcupan ACM 단일 구성 요소 A, M | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | 44611 | Durcupan ACM 단일 성분 A, M 에폭시 수지 |
| Durcupan ACM 단일 성분 B | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | 44612 | Durcupan ACM 단일 성분 B, 경화제 964 |
| Durcupan ACM 단일 성분 D | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | 44614 | Durcupan ACM 단일 성분 D, 가소제 |
| 에틸 알코올 절대 | POCH, Gliwice, Poland | 64-17-5 | 에틸 알코올 절대 99.8 % 순수 P.A.-BASIC |
| Genlab 실험실 오븐 | Wolflabs, York, UK | Mino/18/SS | Oven Genlab MINO/18/SS 18l 용량, 팬 순환 없음, 디지털 디스플레이 없음, 표준 온도 구배, 표준 회수율, 타이머 없음, 250°C; C 최대 온도, 240V 전기 공급 |
| L-아스파르트산 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | A-9256 | 시약 등급, 98% (HPLC) |
| 납(II) 질산 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | 467790 | 99.95% 미량 금속 기초 |
| 오스뮴 테트록사이드 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | 75632 | 전자 현미경, H2O pH 미터에서 4% |
| Elmetron, Zabrze, Poland | CP-5-5 | ||
| Rotator | BioSan, Jó 제프&오아큐티; w, Poland | Multi Bio RS-24 | rotator Multi Bio RS-24 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | S5881 | 시약 등급, 98%, 펠릿(무수) |
| 해바라기 미니 셰이커 | Grant bio, Shepreth, UK | PD-3D | |
| 주사기 필터 | Millipore, Burlington, MA, USA | SLGP033NB | 0,22 &마이크로; m 기공 크기 |
| Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | 88535 | purum pa, 전자 현미경 검사, 99.0% (N) |
| Uranyl acetate | Serva, Heidelberg, Germany | 77870 | Uranyl acetate· 2H2O, 연구 등급 |
| 수조 | WSL, Swietochlowice, 폴란드 | LWT | |
| 96-well | |||
| culture plate | VWR, Radnor, PA, USA | 734-2782 | 96-well plates, round bottom, non treated |
| AM Gatan 3View 스터브 핸들링 핀셋 | Micro to Nano, Haarlem, Netherlands 네덜란드 | 50-001521 | |
| 쌍안 | OPTA-TECH, 바르샤바, 폴란드 | X2000 | |
| 전도성 접착제 | Chemtronics, 조지아, 미국 | CW2400 | 전도성 eopxy |
| Gatan 3View 샘플 핀 스텁 | Micro to Nano, 하를렘, 네덜란드 네덜란드 | 10-006003 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | P7793 | 롤 크기 20 안으로. &시간; 50 ft |
| Pelco 전도성 은 페인트 | Ted Pella, Redding, CA, USA | 16062-15 | PELCO® 전도성 실버 페인트, 15g |
| 면도날 양면 | 현미경 과학, Hatfield, PA, USA | 72000 | 스테인레스 스틸 "PTFE"코팅. PERSONNA 브랜드 .004" 두께, 개별 포장, 상자에 250개의 블레이드. |
| 주사 전자 현미경 | Zeiss, Oberkochen, 독일 | Gatan 3View2 챔버, 가속 전압 2.5 kV, 가변 압력 5 Pa, 조리개 20 µ와 시그마 VP; m, 체류 시간 6 & 마이크로; s, 슬라이스 두께 60 nm, 배율 15 000 x, 이미지 해상도 2048 x 2048 픽셀, 픽셀 크기 7.3 nm | |
| 트림 90° 다이아몬드 나이프 | Diatome Ltd., Nidau, Switzerland | DTB90 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica ultracutR | |
| 소프트웨어 | 웹 페이지 | 자습서 | |
| 피지 | https://fiji.sc/ | ||
| Microscopy Image Browser | http://mib.helsinki.fi/ | http://mib.helsinki.fi/tutorials.html | |
| Reconstruct | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0 | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) | |
| 동물 | |||
| 쥐 | 성체 3개월 된 그리고 20&플러스mn; 1 한 달 여성 Thy1-GFP(M) 마우스(Thy1-GFP +/-)(Feng et al., 2000)는 글루타메이터성 뉴런의 희박하게 분포된 집단에서 GFP를 발현합니다. 동물은 Nencki 실험 생물학 연구소의 Animal House에서 C57BL/6J 배경을 가진 이형접합자로 사육되었습니다. |
참고문헌
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).
- Borczyk, M., Radwanska, K., Giese, K. P. The importance of ultrastructural analysis of memory. Brain Research Bulletin. 173, 28-36 (2021).
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