이 프로토콜은 세포 엑소사이토시스(exocytosis) 및 세포내이입(endocytosis) 주기 동안 지질 막 이동을 모니터링하기 위해 pH에 민감한 지질 형광단 클래스를 사용하는 형광 이미징 방법을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
엑소/엔도사이토시스(exo-/endocytosis)는 세포와 환경 사이 및 서로 다른 세포 간의 생체 분자 교환을 매개하는 일반적인 과정입니다. 특수 세포는 이 과정을 사용하여 β 세포에서 인슐린 분비 및 화학 시냅스에서 신경 전달 물질 방출과 같은 중요한 신체 기능을 수행합니다. 생리학적 중요성으로 인해 외포/세포내이입은 세포 생물학에서 가장 많이 연구되는 주제 중 하나입니다. 유전자 및 단백질 수준에서 이 과정을 연구하기 위해 많은 도구가 개발되었으며, 그 때문에 이 과정에 참여하는 단백질 기계에 대해 많이 알려져 있습니다. 그러나 세포막의 지질 회전율을 측정하기 위한 방법은 거의 개발되지 않았으며, 이는 엑소/내포작용의 물리적 기초입니다.
이 논문은 pH 의존성 형광을 나타내는 새로운 형광 지질 유사체 클래스를 소개하고 원형질막과 분비 소포 사이의 지질 재활용을 추적하는 데 사용하는 방법을 보여줍니다. 간단한 pH 조작을 통해 이러한 유사체는 표면과 세포내 막 구획에 걸친 지질 분포를 정량화할 수 있을 뿐만 아니라 엑소/내포작용 중 지질 회전율을 측정할 수 있습니다. 이 새로운 지질 리포터는 세포 생물학 및 신경 과학과 같은 다양한 생물학 연구 분야에 큰 관심을 가질 것입니다.
서론
지질 이중층은 가장 일반적인 생체 분자 어셈블리 중 하나이며 모든 세포에 없어서는 안될 필수 요소입니다. 세포 외부에서는 세포와 그 환경을 연결하는 원형질막을 형성합니다. 세포 내부에서는 지정된 기능에 특화된 다양한 세포 기관을 구획화합니다. 지질막은 정지된 상태라기보다는 역동적인 융합과 핵분열을 지속적으로 경험하며, 이는 생체 물질 수송, 세포 기관 개혁, 형태 변화 및 세포 통신을 매개합니다. 의심할 여지 없이, 지질막은 거의 모든 세포 과정의 물리적 토대이며, 지질막의 기능 장애는 암1에서 알츠하이머병2에 이르는 다양한 질환에서 중요한 역할을 한다. 지질 분자는 단백질보다 훨씬 덜 다양하지만, 지금까지의 막 연구는 주로 단백질 중심이었습니다. 예를 들어, 엑소사이토시스(exocytosis) 3,4,5에서 지질에 대해 알려진 것보다 단백질 기계에 대해 훨씬 더 많이 알려져 있습니다. 더욱이, 표면 및 세포내 막에 걸친 지질의 조직, 분포, 역학 및 항상성은 막 단백질에 비해 대부분 미연구로 남아 있습니다6<....
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프로토콜
다음 프로토콜에는 (1) 잘 확립된 프로토콜22에 기초하여 마우스 해마 및 피질 배양을 확립하기 위한 간소화된 절차, (2) 살아있는 뉴런에 대한 epifluorescence 현미경 설정에 대한 간략한 소개, (3) 마우스 뉴런에서 ND6 로딩 및 이미징에 대한 자세한 설명, (4) ND6 신호에 의한 막 이동의 정량화에 대한 논의가 포함됩니다. 모든 절차는 플로리다 애틀랜틱 대학교의 생물 안전 및 IACUC 지침을 따릅니다. ND6의 합성은 앞서20에서 설명하였다.
1. 쥐의 해마 및 피질 배양의 준비
알림: 달리 지정하지 않으면 모든 단계는 생물 안전 레벨 2 층류 후드에서 수행해야 합니다. 모든 도구와 재료를 소독하십시오.
- 크기 5 집게를 사용하여 멀티웰 배양 플레이트에 유리 커버슬립을 놓습니다.
참고: 예를 들어, 24웰 플레이트는 12mm
커버슬립에 이상적입니다. - 세포 배양 표면을....
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결과
SV는 유발된 외세포/세포내이입(endocytosis)을 통한 신경전달물질 방출에 특화되어있다 27. SV는 ND6에 이상적인 고산성 루멘(즉, pH 5.5)을 가지고 있습니다. 우리는 ND6가 SV에 접근할 수 있도록 SV exo-/endocytosis를 유발하기 위해 높은 K+ 자극을 사용했습니다. 예상대로, 뉴런 과정을 따라 밝은 녹색 형광 반점이 로딩 후에 나타났습니다(그림 9A). 그림 4B 에 표시된 라인 프로파일은 ND6(녹색 곡선)과 FM4-64 점점(빨간색 곡선) 사이의 강한 중첩을 보여주었습니다. ND6와 FM4-64 형광 강도 간의 강한 상관관계는 ND6의 SV 염색을 시사합니다(그림 9B).
전기 자극과 높은 K+ 자극을 사용하여 각각 쉽게 .......
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토론
1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine(DiI) 및 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate(DiO)와 같은 지질 기반 염료는 세포 형태를 설명하고 뉴런의 축삭 돌출과 같은 세포 과정을 추적하는 데 오랫동안 사용되어 왔습니다. FM1-43과 같은 스티릴 염료는 exocytosis34 연구를 위해 발명되어 성공적으로 사용되었습니다. 막 친화도가 낮기 때문에 세포내이입된 소포가 갇혀 있는 곳에 선택적으로 라벨을 붙이고 원형질막에 남아 있는 염료는 일정한 관류에 의해 씻겨 나갑니다. 따라서 스티릴 염료는 소포 재활용의 지속적인 모니터링에 적합하지 않습니다.
pH 민감성 GFP(즉, pHluorin)의 최근 발명으로 VAMPII 또는 Synaptophysin35와 같은 소포 막 단백질에 태그를 붙일 때 소포.......
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공개 사항
저자는 재정적 이익이 상충되지 않는다고 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 플로리다 애틀랜틱 대학교 학부 연구 및 조사 사무국(M.J.S.), 플로리다 보건부 에드 및 에델 무어 파일럿 보조금 20A17(Q.Z.), 알츠하이머 협회 보조금 AARG-NTF-19-618710(Q.Z.) 및 NIA R21 보조금 AG061656-01A1(Q.Z.)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Digidata 1440A 데이터 수집 시스템 | 분자 장치 | Digidata 1440A | 동기화 자극 및 용액 교환용 |
| 이중 채널 온도 컨트롤러 | Warner Instruments | TC-344B | 라이브 셀 이미징용 |
| 태아 소 혈청 | OMEGA Scientific | FB-01 | 해부 및 조직 배양에 사용되는 H+20 용액 제조용 |
| Hamamatsu Flash4.0 sCOMS 카메라 | 하마마츠 주식회사 | C13440-20CU | 고감도 카메라 |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | 해부 및 조직 배양에 사용되는 H+20 용액 제조용 |
| 가열식 플랫폼 | Warner Instruments | PH-1 | 라이브 셀 이미징용 |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | 조직 배양용 |
| Micro-G 진동 절연 테이블 | TMC | 63-564 | 라이브 셀 이미징용 |
| Micro-manager | https://micro-manager.org/ | NA | 이미지 획득 제어용 |
| Multi-Line In-Line Solution Heater | Warner Instruments | SHM-6 | 라이브 셀 이미징용 |
| Neurobasal Plus Medium | THermoFisher Scientific | A3582901 | 조직 배양용 |
| Nikon Ti-E 도립 현미경 | Nikon | Ti-E/B | 생세포 이미징용 |
| ORCA-Flash4.0 디지털 CMOS 카메라 | Hamamatsu | C1340-20CU | 라이브 셀 이미징 |
| 용 관류 챔버 | Warner Instruments | RC-26G | 라이브 셀 이미징 |
| 용 6 채널 밸브 제어 관류 시스템 | Warner Instruments | VC-6 | 솔루션 교환 |
| 용 사각 펄스 자극기 | 잔디 기기 | SD9 | 전기장 자극 용 |
참고문헌
- Polo, S., Pece, S., Di Fiore, P. P. Endocytosis and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 16 (2), 156-161 (2004).
- Eckert, G. P., Wood, W. G., Muller, W. E. Lipid membranes and beta-amyloid: a harmful connection. Current Protein and Pept Science. 11 (5), 319-325 (2010....
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