सक्रिय Caenorhabditis elegans परमाणु निकालें और इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए पुनर्गठन के अलगाव
Summary
यहां, हम लार्वा चरण 4 सी एलिगन्स से सक्रिय परमाणु अर्क को अलग करने और इन विट्रो सिस्टम में प्रतिलेखन गतिविधि की कल्पना करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Abstract
Caenorhabditis elegans जैविक अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली रही है क्योंकि इसे 1963 में पेश किया गया था। हालांकि, सी एलिगन्स को अपने परमाणु अर्क जैसे इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन और डीएनए प्रतिकृति का उपयोग करके जैविक प्रतिक्रियाओं के जैव रासायनिक अध्ययन में पूरी तरह से उपयोग नहीं किया गया है। जैव रासायनिक अध्ययन में सी एलिगन्स का उपयोग करने के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा परमाणु अर्क की गतिविधि का त्याग किए बिना नेमाटोड के मोटे बाहरी छल्ली को बाधित कर रही है। जबकि छल्ली को तोड़ने के लिए कई तरीकों का उपयोग किया जाता है, जैसे कि डॉन्स होमोजेनाइजेशन या sonication, वे अक्सर प्रोटीन अस्थिरता का कारण बनते हैं। इन विट्रो प्रतिक्रियाओं के लिए लार्वा या वयस्क सी एलिगन्स से सक्रिय परमाणु प्रोटीन को अलग करने के लिए कोई स्थापित प्रोटोकॉल नहीं हैं। यहां, प्रोटोकॉल विस्तार से लार्वा चरण 4 सी elegans के homogenization एक Balch homogenizer का उपयोग कर वर्णन करता है. Balch homogenizer इस प्रक्रिया में छल्ली को तोड़ने वाले एक संकीर्ण अंतराल के माध्यम से जानवरों को धीरे-धीरे मजबूर करने के लिए दबाव का उपयोग करता है। बाल्च homogenizer के वर्दी डिजाइन और सटीक मशीनिंग प्रयोगों के बीच जानवरों के लगातार पीसने के लिए अनुमति देते हैं। Balch homogenizer से प्राप्त homogenate fractionating कार्यात्मक रूप से सक्रिय परमाणु निकालने है कि C. elegans के प्रतिलेखन गतिविधि assaying के लिए एक इन विट्रो विधि में इस्तेमाल किया जा सकता है पैदावार.
Introduction
छोटे, मुक्त रहने वाले नेमाटोड Caenorhabditis elegans जैविक प्रश्नों की एक विस्तृत श्रृंखला को संबोधित करने के लिए एक सरल अभी तक शक्तिशाली मॉडल जीव है। 1963 में इसकी शुरुआत के बाद से, नेमाटोड न्यूरोबायोलॉजी, चयापचय, उम्र बढ़ने, विकास, प्रतिरक्षा और आनुवंशिकी में सवालों के जवाब देने के लिए अमूल्य रहे हैं। जानवर की कई विशेषताओं में से कुछ जो इसे एक आदर्श मॉडल जीव बनाते हैं, उनमें छोटी पीढ़ी का समय, आरएनए हस्तक्षेप की प्रभावशीलता, पारदर्शी शरीर और इसके सेलुलर वंश और तंत्रिका तंत्र दोनों के पूर्ण नक्शे शामिल हैं।
जबकि विज्ञान में सूत्रकृमि का योगदान विशाल है, उन्हें यूकेरियोटिक प्रतिलेखन प्रणाली को स्पष्ट करने के लिए कम उपयोग किया गया है, इन तंत्रों के बारे में हमारी अधिकांश समझ खमीर, फल मक्खी और स्तनधारी सेल कल्चर 2 से परमाणु अर्क का उपयोग करके अध्ययन से आ रही है। सबसे बड़ी बाधा जो शोधकर्ताओं को कार्यात्मक परमाणु अर्क निकालने से रोकती है, वह नेमाटोड की कठिन बाहरी छल्ली है। इस एक्सोस्केलेटन में क्रॉस-लिंक्ड कोलेजन, क्यूटिकलिन, ग्लाइकोप्रोटीन और लिपिड शामिल हैं, जिससे लार्वा चरण से वयस्कता तक सी एलिगेंस रासायनिक या यांत्रिक बलों के माध्यम से प्रोटीन निष्कर्षण के लिए प्रतिरोधी हो जाते हैं3। C. elegans परमाणु निकालने का उपयोग करके एक इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन सिस्टम एक बार विकसित किया गया था, लेकिन सिस्टम के सीमित दायरे के कारण व्यापक रूप से अपनाया नहीं गया था, और अर्क तैयार करने के लिए Dounce homogenizer का उपयोग प्रोटीन अस्थिरता 4,5 को जन्म दे सकता है।
परमाणु निकालने अलगाव के लिए पिछले प्रोटोकॉल के विपरीत, जिसने C. elegans को तोड़ने के लिए एक Dounce homogenizer का उपयोग किया, यह प्रोटोकॉल एक Balch homogenizer का उपयोग करता है। Balch homogenizer में दो मुख्य घटक होते हैं: एक टंगस्टन कार्बाइड बॉल और एक स्टेनलेस-स्टील ब्लॉक जिसमें एक चैनल एक छोर से दूसरे छोर तक ऊब जाता है। Balch homogenizer टंगस्टन कार्बाइड गेंद के साथ भरी हुई है और पीसने कक्ष सील करने के लिए दोनों तरफ से छाया हुआ है। सिरिंज को पीसने वाले कक्ष में अग्रणी दो ऊर्ध्वाधर बंदरगाहों पर लोड किया जा सकता है। जैसा कि सामग्री को पीसने वाले कक्ष के माध्यम से एक सिरिंज से दूसरे में पारित किया जाता है, सिरिंज से दबाव गेंद और कक्ष की दीवार के बीच एक संकीर्ण अंतर के माध्यम से सामग्री को मजबूर करता है। यह धीमा और निरंतर दबाव सामग्री को तब तक तोड़ता है जब तक कि यह एक सुसंगत आकार तक नहीं पहुंच जाता है जो आसानी से संकीर्ण अंतराल से गुजरने में सक्षम होता है। एक निरंतर अभी तक कोमल दबाव के माध्यम से संकीर्ण अंतर के माध्यम से सी elegans मजबूर जानवरों को खुला तोड़ता है, आसपास के बफर में अपनी सामग्री जारी करता है। गेंद के आकार को स्विच करना अंतर को और कड़ा करता है, नई जारी कोशिकाओं को तोड़ता है और नाभिक को बफर में मुक्त करता है। सेंट्रीफ्यूजेशन के कई उदाहरण नाभिक को सेल मलबे के बाकी हिस्सों से अलग करते हैं, जिससे एक स्वच्छ परमाणु अर्क के संग्रह की अनुमति मिलती है। बाल्च होमोजेनाइज़र को कई कारणों से डौंस होमोजेनाइज़र पर पसंद किया जाता है: सिस्टम बड़ी संख्या में जानवरों को संभाल सकता है, जिससे एक ही प्रयास में सक्रिय प्रोटीन की उच्च मात्रा को निकालना संभव हो जाता है; गेंदों और स्टील ब्लॉक की सटीक मशीनिंग कई नमूनों के बीच लगातार पीसने के लिए अनुमति देता है; भारी स्टील ब्लॉक एक गर्मी सिंक के रूप में कार्य करता है, समान रूप से पीसने वाले कक्ष से दूर गर्मी खींचता है, विकृतीकरण को रोकता है।
अलगाव के बाद, परमाणु निकालने ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को किसी भी जैव रासायनिक प्रयोगों में उपयोग किए जाने से पहले सत्यापित किया जाना चाहिए। परंपरागत रूप से, प्रतिलेखन गतिविधि को नए संश्लेषित आरएनए को ट्रैक करने और कल्पना करने के लिए रेडियोलेबल न्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग करके मापा गया था। हालांकि, रेडियोधर्मी लेबलिंग बोझिल हो सकती है क्योंकि इसके लिए उपयोग और निपटान के दौरान सावधानी की आवश्यकता होती है6। तकनीकी प्रगति आज शोधकर्ताओं को मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) जैसी तकनीकों का उपयोग करके छोटी आरएनए मात्रा को मापने के लिए बहुत कम हानिकारक या परेशानी वाले तरीकों का उपयोग करने की अनुमति देती है। यहां, प्रोटोकॉल लार्वा चरण 4 (एल 4) सी एलिगेंस से सक्रिय परमाणु अर्क को अलग करने और इन विट्रो सिस्टम में प्रतिलेखन गतिविधि की कल्पना करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans यूकेरियोटिक प्रतिलेखन प्रणाली का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल जीव है क्योंकि इसकी कम लागत वाले रखरखाव और आनुवंशिक हेरफेर में आसानी है। यहाँ L4 C. elegans से कार्यात्मक रूप से सक्रिय परमाणु नि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एक NIH MIRA अनुदान (R35GM124678 J. S. के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Consumables and reagents | |||
| 0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear | Genesee Scientific | 24-706 | |
| 0.2 mL Individual PCR tubes | Genesee Scientific | 24-153G | |
| 1.7 mL sterile microtubes | Genesee Scientific | 24-282S | |
| 100% absolute molecular grade ethanol | Fisher Scientific | BP2818 | |
| 100% ethanol, Koptec | Decon Labs | V1001 | |
| 10 mL serological pipet | VWR international | 89130-898 | |
| 150 mm petri plates | Tritech Research | T3325 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Genesee Scientific | 28-103 | |
| 20 mL plastic syringes | Fisher Scientific | 14955460 | |
| 2 mL Norm-Ject syringes | Henke-Sass Wolf GmbH | 4020 | |
| 500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus | Millipore Sigma | SCGPU10RE | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| 50 mL serological pipet | VWR international | 89130-902 | |
| 5 mL serological pipet | VWR international | 89130-896 | |
| Agar, Criterion | VWR International | C7432 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Alcohol proof marker | VWR International | 52877-310 | |
| Bacto peptone | VWR International | 90000-264 | |
| Caenorhabditis elegans | CGC | N2 | |
| Calcium dichloride | Millipore Sigma | C4901 | |
| Cholesterol | Millipore Sigma | C8667 | |
| Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’ | |||
| Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’ | |||
| Deionized water | |||
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| DNA gel stain, SYBR safe | Invitrogen | S33102 | |
| DNA ladder mix, O’gene ruler | Fisher Scientific | SM1173 | |
| DNA Loading Dye, 6x TriTrack | Fisher Scientific | FERR1161 | |
| DNase, Baseline-ZERO | Lucigen | DB0715K | |
| Dry ice | |||
| Escherichia coli OP50 strain | CGC | OP50 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38 | |
| Glycerol | Millipore Sigma | G6279 | |
| HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe | Promega | E3110 | |
| Hepes Solution, 1 M Gibco | Millipore Sigma | 15630080 | |
| Hydrochloric acid 37% | Millipore Sigma | P0662 | |
| Hypochlorite bleach | Clorox | ||
| LB Broth | Millipore Sigma | L3022 | |
| Magnesium dichloride | Millipore Sigma | M8266 | |
| Magnesium Sulfate | Millipore Sigma | M7506 | |
| Medium weigh dishes | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| microscope slides, Vista vision | VWR International | 16004-368 | |
| molecular grade water, Hypure | Hyclone Laboratories | SH30538 | |
| Nystatin | Millipore Sigma | N1638 | |
| PCR system, FailSafe with premix A | Lucigen | FS99100 | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P39111 | |
| Potassium phosphate dibasic | Millipore Sigma | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P0662 | |
| Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| protein assay kit, Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33211 | |
| reverse transcription kit, Sensiscript | Qiagen | 205211 | |
| RNA extraction kit RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| RNase Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sodium Chloride | VWR International | BDH9286-12KG | |
| Sodium hydroxide | Millipore Sigma | 1-09137 | |
| Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane | VWR international | 28145-501 | |
| Sucrose | VWR International | 200-334-9 | |
| transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’ | |||
| transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’ | |||
| Tris-Base | Fisher Scientific | BP152 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 | |
| Equipment | |||
| -20 °C incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| 20 °C incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| 37 °C incubator | Forma Scientific | ||
| 4 °C refrigerator | ThermoFisher Scientific | ||
| -80 °C freezer | Eppendorf | ||
| Autoclave | Sanyo | ||
| Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer | Isobiotec | ||
| Benchtop Vortexer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Centrifuge, Eppendorf 5418 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Centrifuge, VWR Clinical 50 | VWR International | 82013-800 | |
| Dissection microscope, Leica M80 | Leica Microsystems | ||
| Fluorometer, Qubit 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Gel imaging system, iBright FL1500 | ThermoFisher Scientific | A44241 | |
| Gel system | ThermoFisher Scientific | ||
| Heat block | VWR International | 12621-048 | |
| Microcentrifuges, Eppendorf 5424 | Eppendorf | 22620401 | |
| PIPETBOY acu 2 | Integra | 155017 | |
| Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014382 | |
| Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014388 | |
| Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014391 | |
| Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014392 | |
| Rocking platform | VWR International | ||
| Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro | Eppendorf | 950030010 |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. 유전학. 200 (2), 387-407 (2015).
- Blackwell, T. K., Walker, A. K. Transcription mechanisms. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-16 (2006).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-15 (2007).
- Lichtsteiner, S., Tjian, R. Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).
- Lichtsteiner, S., Tjian, R. Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts. EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).
- Shan, G., et al. Isotope-labeled immunoassays without radiation waste. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).
- Voss, C., et al. A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity. BMC Molecular Biology. 15, 7 (2014).
- Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system. BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87 (2020).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
- Zbacnik, T. J., et al. Role of buffers in protein formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).
