JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생체공학

Snelle, enzymatische methoden voor versterking van minimale, lineaire sjablonen voor eiwitprototypering met behulp van celvrije systemen

Published: June 14, 2021
doi:
10.3791/62728
,
1Chemical and Biological Engineering,Iowa State University

Summary

De studie beschrijft een protocol voor het maken van grote (μg-mg) hoeveelheden DNA voor eiwitscreeningcampagnes uit synthetische genfragmenten zonder klonen of het gebruik van levende cellen. De minimale sjabloon wordt enzymatisch verteerd en gecicirkeld en vervolgens versterkt met behulp van isothermische rollende cirkelversterking. Celvrije expressiereacties konden worden uitgevoerd met het ongezuiverde product.

Abstract

Dit protocol beschrijft het ontwerp van een minimale DNA-sjabloon en de stappen voor enzymatische amplificatie, waardoor snelle prototyping van testbare eiwitten in minder dan 24 uur mogelijk is met behulp van celvrije expressie. Na ontvangst van DNA van een leverancier wordt het genfragment PCR-versterkt, gesneden, gecirculiseerd en cryo-banked. Een kleine hoeveelheid van het gebankte DNA wordt vervolgens verdund en aanzienlijk versterkt (tot 106x) met behulp van isotherme rollende cirkelversterking (RCA). RCA kan microgramhoeveelheden van de minimale expressiesjabloon opleveren uit picogramniveaus van uitgangsmateriaal (mg-niveaus als alle beginnende synthetische fragmenten worden gebruikt). In dit werk resulteerde een starthoeveelheid van 20 pg in 4 μg van het eindproduct. Het resulterende RCA-product (aaneenschakeling van de minimale sjabloon) kan direct worden toegevoegd aan een celvrije reactie zonder zuiveringsstappen. Omdat deze methode volledig pcr-gebaseerd is, kan het toekomstige screeningsinspanningen met hoge doorvoer mogelijk maken in combinatie met geautomatiseerde vloeistofbehandelingssystemen.

Introduction

Celvrije genexpressie (CFE) is naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel met vele toepassingen. Dergelijke toepassingenomvatten ziektedetectie1,2,3,4,5,6,micronutriënten en detectie van kleinemoleculen 7,8,9,10,11,12,biomanufacturing13,14,15,16,17 ,18, onderwijs19,20,21, productie van moeilijke eiwitten17,22,23,24,25,26,27, en variant screening23,28,29,30,31,32 ,33. Dit komt door het open karakter van celvrije systemen en de flexibiliteit die ze bieden. Veel geweldige overzichtsartikelen bieden historisch onderwijs en toekomstperspectieven op de technologie34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44.

Een typische celvrije reactie bestaat uit drie belangrijke componenten: celextract, energiemix en genetische sjabloon. Actief celextract bevat alle benodigde machines voor transcriptie en vertaling (TXTL) en kan op verschillende manieren worden verwerkt36. Glycolytische tussenproducten, elektrolyten, aminozuren en cofactoren in de energiemix ondersteunen het TXTL-proces. Het is een belangrijke bron van variabiliteit in celvrije experimenten45 en kan op vele manieren worden voorbereid34,46. De voorbereiding van de genetische sjabloon heeft minder verbeteringen ondergaan, omdat traditionele kloonmethoden resulteren in plasmiden met uitstekende expressiekenmerken. Het nadeel van deze traditionele methoden is de doorlooptijd en de hoeveelheid biologische expertise die nodig is om ze te bouwen en te vermeerderen. Recente optimalisatie-inspanningen hebben geresulteerd in eenvoudige 24-uurs workflows voor celextractbereiding47,48 die parallel met energiemixvoorbereiding49,50kunnen worden uitgevoerd. Traditioneel klonen voegt echter meerdere dagen toe aan de cfe prototyping tijdlijn (Tabel 1)23. Snel versterkte PCR-producten uit het commerciële genfragment kunnen direct worden gebruikt51, maar dit beperkt het aantal prototyping-experimenten omdat slechts 1 μg DNA wordt geproduceerd, wat overeenkomt met ongeveer vijf reacties (traditionele volumes van 15 μL). Met deze extra stappen van circularisatie en isotherme amplificatie is meer dan milligram hoeveelheden van het DNA mogelijk (~ 5.000 reacties voor 1 mg). Dit verhoogt drastisch het aantal tests dat kan worden uitgevoerd in high-throughput screening van eiwitten of combinatorische enzymnetwerken (celvrije metabole engineering); het zorgt ook voor een effectieve conservering van de lineaire sjabloonbibliotheek als DNA met hoge concentratie. Bovendien zou een grotere hoeveelheid sjabloon nodig zijn om grotere hoeveelheden eiwit te prototypen die nodig zijn voor materiaalwetenschappelijke toepassingen (op eiwitten gebaseerde vezels en hydrogels). Sommige beperkingen van lineaire sjablonen kunnen worden overwonnen door een uittreksel van BL21 DE3 Star te gebruiken of recent ontdekte methoden te gebruiken om lineaire sjablonen te beschermen tegen degradatie52,53,54. Dit heeft echter geen betrekking op het hebben van beperkte voorraden door de leverancier geproduceerd DNA voor PCR-amplificatie of de kwestie van biologische expertise en apparatuur die nodig is voor klonen.

Dit werk presenteert een protocol dat expliciet is ontworpen om de hoeveelheid expressiesjabloon te verhogen die kan worden verkregen uit kleine hoeveelheden door de leverancier geproduceerde genfragmenten (meestal 500-1000 ng gelyofiliseerd poeder). De beschreven methode vereist niet de vaardigheden die nodig zijn om traditioneel klonen in plasmiden uit te voeren of te transformeren en te vermeerderen in levende cellen. Na ontvangst van een genfragment in de post kan een gebruiker voldoende sjablonen produceren voor veel celvrije reacties door gebruik te maken van isotherme rollende cirkelversterking (RCA) (Figuur 1)23. Hoewel de hoeveelheid DNA die van de leverancier wordt ontvangen voldoende kan zijn voor beperkte screeningsinspanningen, is deze snel uitgeput en is het opnieuw kopen van genfragmenten tijdrovend en kostbaar. De methode is ook bijzonder geschikt voor genen die giftig en moeilijk te klonen zijn in E. coli.

Protocol

1. Het ontwerpen van het genfragment OPMERKING: Het genfragment moet alle noodzakelijke genetische elementen bevatten voor transcriptie /translatie, inclusief promotor, ribosoombindingsplaats (RBS), startcodon, het gen van belang en terminator. Hoewel de terminator niet nodig is voor een lineaire expressiesjabloon (LET), is het belangrijk als de gebruiker besluit de reeks in een plasmide in te voegen. Deze sequenties werden opgetild uit het pJL1-sfGFP-plasmide55 (geschenk…

Representative Results

Expressie van sfGFP uit RCA-sjablonen was vergelijkbaar met die van het pJL1-plasmide bij gebruik van slechts 0,30 μL ongezuiverd RCA-DNA in een reactie van 15 μL(figuur 2A). In feite lijkt het verdubbelen en verdrievoudigen van de hoeveelheid sjabloon geen voordeel te bieden in BL21 DE3 Star-extract, wat suggereert dat de sjabloon al verzadigd is met 0,30 μL per reactie. Omgekeerd lijkt er een voordeel te zijn aan het verhogen van de hoeveelheid RCA-sjabloon wanneer deze wordt toegevoegd…

Discussion

Het gen van belang kan elk gewenst eiwit zijn, maar het is het beste om te beginnen met een fluorescerend eiwit als een handige verslaggever voor real-time of eindpuntuitlezing op een putplaatlezer voor nieuwe gebruikers van deze methode. Voor nieuwe eiwitsequenties kopieert u de aminozuursequentie van het gewenste eiwit en plakt u deze in de gewenste codonoptimalisatietool61,62. Er zijn meestal veel beschikbare organismen en stammen van E. coli in de co…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs erkennen NIH 1R35GM138265-01 en NSF 2029532 voor gedeeltelijke ondersteuning van dit project.

Materials

Alaline Formedium DOC0102
Ammonium glutamate MP Biomedicals MP21805951
Arginine Formedium DOC0106
Asparagine Formedium DOC0114
Aspartic Acid Formedium DOC0118
ATP Sigma A2383
Axygen Sealing Film Corning PCR-SP
CMP Sigma C1006
Coenzyme A Sigma C3144
CutSmart Buffer NEB B7204S Provided with HindIII
Cysteine Formedium DOC0122
DNA Clean and Concentrator Kit Zymo Research D4004 Used for purifying DNA
dNTPs NEB N0447
E. coli tRNA Sigma (Roche) 10109541001
Folinic Acid Sigma 47612
Gene Fragment IDT
Glutamic Acid Formedium DOC0134
Glutamine Formedium DOC0130
Glycine Formedium DOC0138
GMP Sigma G8377
HEPES Sigma H3375
HindIII-HF NEB R3104L
Histidine Formedium DOC0142
Isoleucine Formedium DOC0150
Leucine Formedium DOC0154
Lysine Formedium DOC0158
Magnesium glutamate Sigma 49605
Methionine Formedium DOC0166
Microtiter Plate (384 well) Greiner 781906
Microtiter Plate (96 well) Greiner 655809
Multimode Plate Reader BioTek Synergy Neo2
NAD Sigma N8535
NanoPhotometer Implen NP80
OneTaq DNA Polymerase NEB M0480
PCR Tube VWR 20170-012
Phenylalanine Formedium DOC0170
Phosphoenolpyruvate Sigma (Roche) 10108294
Potassium glutamate Sigma G1501
Potassium oxalate Fisher Scientific P273
Proline Formedium DOC0174
Putrescine Sigma P5780
Serine Formedium DOC0178
Spermidine Sigma S0266
T4 DNA Ligase NEB M0202S
T4 DNA Ligase Reaction Buffer NEB B0202S Provided with T4 DNA Ligase
TempliPhi Amplification Kit Cytiva 25640010 Used for RCA
Thermal Cycler Biorad C1000 Touch
Thermoblock Eppendorf ThermoMixer FP
Threonine Formedium DOC0182
Tryptophan Formedium DOC0186
Tyrosine Formedium DOC0190
UMP Sigma U6375
Valine Formedium DOC0194
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sun, Q., et al. A simple and low-cost paper-based colorimetric method for detecting and distinguishing the GII.4 and GII.17 genotypes of norovirus. Talanta. 225, 121978 (2021).
  2. Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  3. Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  4. Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment. Synthetic Biology. 3 (1), (2018).
  5. Park, S., Lee, J. W. Detection of coronaviruses using rna toehold switch sensors. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1772 (2021).
  6. Cao, M., Sun, Q., Zhang, X., Ma, Y., Wang, J. Detection and differentiation of respiratory syncytial virus subgroups A and B with colorimetric toehold switch sensors in a paper-based cell-free system. Biosensors and Bioelectronics. 182, 113173 (2021).
  7. Mcnerney, M. P., et al. Point-of-care biomarker quantification enabled by sample-specific calibration. Science Advances. 5 (9), (2019).
  8. Silverman, A. D., Akova, U., Alam, K. K., Jewett, M. C., Lucks, J. B. Design and optimization of a cell-free atrazine biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (3), 671-677 (2020).
  9. Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTRβ-specific endocrine disruptors. Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).
  10. Garamella, J., Majumder, S., Liu, A. P., Noireaux, V. An adaptive synthetic cell based on mechanosensing, biosensing, and inducible gene circuits. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1913-1920 (2019).
  11. Glasscock, C. J., et al. Dynamic control of pathway expression with riboregulated switchable feedback promoters. ACS Synthetic Biology. 16, (2019).
  12. Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
  13. Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
  14. Nelson, J. A. D., et al. Hydrofoam and oxygen headspace bioreactors improve cell-free therapeutic protein production yields through enhanced oxygen transport. Biotechnology Progress. 37 (2), 3079 (2020).
  15. Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
  16. Ogonah, O. W., Polizzi, K. M., Bracewell, D. G. Cell free protein synthesis: a viable option for stratified medicines manufacturing? A brief history of cell free synthesis systems. Current Opinion in Chemical Engineering. 18, 77-83 (2017).
  17. Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  18. Stark, J. C., et al. On-demand biomanufacturing of protective conjugate vaccines. Science Advances. 7 (6), (2021).
  19. Huang, A., et al. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 1-11 (2018).
  20. Stark, J. C., et al. BioBits health: classroom activities exploring engineering, biology, and human health with fluorescent readouts. ACS Synthetic Biology. 8 (5), 1001-1009 (2019).
  21. Stark, J. C., et al. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 33 (2018).
  22. Shinoda, T., et al. Cell-free methods to produce structurally intact mammalian membrane proteins. Scientific Reports. 6, (2016).
  23. Dopp, J. L., Rothstein, S. M., Mansell, T. J., Reuel, N. F. Rapid prototyping of proteins: Mail order gene fragments to assayable proteins within 24 hours. Biotechnology and Bioengineering. 116 (3), 667-676 (2019).
  24. Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
  25. Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnology Journal. 11 (2), 274-281 (2016).
  26. Georgi, V., et al. On-chip automation of cell-free protein synthesis: New opportunities due to a novel reaction mode. Lab on a Chip. 16 (2), 269-281 (2016).
  27. Thoring, L., et al. Cell-free systems based on CHO cell lysates: Optimization strategies, synthesis of “difficult-to-express” proteins and future perspectives. PLoS One. 11 (9), (2016).
  28. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Simple, functional, inexpensive cell extract for in vitro prototyping of proteins with disulfide bonds. Biochemical Engineering Journal. 164, 107790 (2020).
  29. Isaksson, L., Enberg, J., Neutze, R., Göran Karlsson, B., Pedersen, A. Expression screening of membrane proteins with cell-free protein synthesis. Protein Expression and Purification. 82 (1), 218-225 (2012).
  30. Techner, J. M., et al. High-throughput synthesis and analysis of intact glycoproteins using SAMDI-MS. Analytical Chemistry. 92 (2), 1963-1971 (2020).
  31. Kim, H. C., et al. Implementing bacterial acid resistance into cell-free protein synthesis for buffer-free expression and screening of enzymes. Biotechnology and Bioengineering. 112 (12), 2630-2635 (2015).
  32. Rolf, J., Siedentop, R., Lütz, S., Rosenthal, K. Screening and identification of novel cGAS homologues using a combination of in vitro and in vivo protein synthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), (2020).
  33. Haslinger, K., Hackl, T., Prather, K. L. J. Rapid in vitro prototyping of O-methyltransferases for pathway applications in Escherichia coli. bioRxiv. , (2020).
  34. Dopp, J. L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2018).
  35. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 24 (2019).
  36. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  37. Chiba, C. H., Knirsch, M. C., Azzoni, A. R., Moreira, A. R., Stephano, M. A. Cell-free protein synthesis: advances on production process for biopharmaceuticals and immunobiological products. BioTechniques. 70, (2021).
  38. Laohakunakorn, N. Cell-free systems: A proving ground for rational biodesign. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).
  39. Dondapati, S. K., Stech, M., Zemella, A., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: A promising option for future drug development. BioDrugs. , 1-22 (2020).
  40. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
  41. Khambhati, K., et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
  42. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
  43. Rosenblum, G., Cooperman, B. S. Engine out of the chassis: Cell-free protein synthesis and its uses. FEBS Letters. 588 (2), 261-268 (2014).
  44. Swartz, J. R. Transforming biochemical engineering with cell-free biology. AIChE Journal. 58 (1), 5-13 (2012).
  45. Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
  46. Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
  47. Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-hour workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
  48. Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of “endotoxin-free” ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
  49. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  50. Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e50762 (2013).
  51. Schinn, S. M., Broadbent, A., Bradley, W. T., Bundy, B. C. Protein synthesis directly from PCR: Progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 480-487 (2016).
  52. Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
  53. Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114, 2137-2141 (2017).
  54. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
  55. . Addgene: pJL1 Available from: https://www.addgene.org/69496/ (2021)
  56. . IDT Codon Optimization Tool Available from: https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool (2021)
  57. Hadi, T., et al. Rolling circle amplification of synthetic DNA accelerates biocatalytic determination of enzyme activity relative to conventional methods. Scientific Reports. 10 (1), 10279 (2020).
  58. . New England Biolabs Tm Calculator Available from: https://tmcalculator.neb.com/#!/main (2021)
  59. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, (2010).
  60. Colant, N., et al. A rational approach to improving titer in Escherichia coli-based cell-free protein synthesis reactions. Biotechnology Progress. 37 (1), 3062 (2021).
  61. Burgess-Brown, N. A., et al. Codon optimization can improve expression of human genes in Escherichia coli: A multi-gene study. Protein Expression and Purification. 59, 94-102 (2008).
  62. Maertens, B., et al. Gene optimization mechanisms: A multi-gene study reveals a high success rate of full-length human proteins expressed in Escherichia coli. Protein Science. 19 (7), 1312-1326 (2010).
  63. Eckert, K. A., Kunkel, T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Genome Research. 1 (1), 17-24 (1991).
  64. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
  65. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
  66. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58882 (2019).
  67. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, (2015).

Tags

Cell-free SystemsProtein PrototypingRolling Circle AmplificationPCRDNA TemplateRestriction DigestionDNA LigationEnzymatic Amplification
check_url/kr/62728?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems. J. Vis. Exp. (172), e62728, doi:10.3791/62728 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image