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Abstract
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생체공학

Schnelle, enzymatische Methoden zur Amplifikation minimaler, linearer Templates für das Protein-Prototyping mit zellfreien Systemen

Published: June 14, 2021
doi:
10.3791/62728
,
1Chemical and Biological Engineering,Iowa State University

Summary

Die Studie beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung großer (μg-mg) Mengen an DNA für Protein-Screening-Kampagnen aus synthetischen Genfragmenten ohne Klonen oder Verwendung lebender Zellen. Die minimale Schablone wird enzymatisch verdaut und zirkuliert und dann mit isothermer Rollkreisamplifikation amplifiziert. Zellfreie Expressionsreaktionen könnten mit dem ungemeinigten Produkt durchgeführt werden.

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt das Design einer minimalen DNA-Schablone und die Schritte zur enzymatischen Amplifikation, die ein schnelles Prototyping von assaybaren Proteinen in weniger als 24 h unter verwendung zellfreier Expression ermöglicht. Nach Erhalt der DNA von einem Anbieter wird das Genfragment PCR-amplifiziert, geschnitten, zirkuliert und kryo-bankiert. Eine kleine Menge der bankierten DNA wird dann verdünnt und signifikant (bis zu 106x) mittels isothermer Rollkreisamplifikation (RCA) amplifiziert. RCA kann Mikrogrammmengen der minimalen Expressionsvorlage aus Pikogrammwerten des Ausgangsmaterials liefern (mg-Werte, wenn alle synthetischen Ausgangsfragmente verwendet werden). Bei dieser Arbeit ergab eine Ausgangsmenge von 20 pg 4 μg des Endprodukts. Das resultierende Cinch-Produkt (Konatemer der minimalen Schablone) kann ohne Reinigungsschritte direkt zu einer zellfreien Reaktion hinzugefügt werden. Da diese Methode vollständig PCR-basiert ist, kann sie in Verbindung mit automatisierten Liquid-Handling-Systemen zukünftige Hochdurchsatz-Screening-Bemühungen ermöglichen.

Introduction

Die zellfreie Genexpression (CFE) hat sich zu einem leistungsstarken Werkzeug mit vielen Anwendungen entwickelt. Solche Anwendungen umfassen krankheitsnachweis1,2,3,4,5,6, Mikronährstoff- und niedermolekulare Detektion7,8,9,10,11,12 , Bioproduktion13,14,15,16,17 ,18, Ausbildung19,20,21, Herstellung schwieriger Proteine17,22,23,24,25,26,27, und Variantenscreening23,28,29,30,31,32 ,33. Dies liegt an der Offenheit zellfreier Systeme und der Flexibilität, die sie bieten. Viele großartige Übersichtsartikel bieten historische Bildung und Zukunftsperspektiven auf die Technologie34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44.

Eine typische zellfreie Reaktion besteht aus drei Hauptkomponenten: Zellextrakt, Energiemix und genetische Vorlage. Aktiver Zellextrakt enthält alle notwendigen Maschinen für Transkription und Translation (TXTL) und kann auf vielfältige Weise verarbeitet werden36. Glykolytische Zwischenprodukte, Elektrolyte, Aminosäuren und Cofaktoren im Energiemix unterstützen den TXTL-Prozess. Es ist eine Hauptquelle der Variabilität in zellfreien Experimenten45 und kann auf viele Arten hergestellt werden34,46. Die Präparation der genetischen Vorlage hat weniger Verbesserungen erfahren, da traditionelle Klonierungsmethoden zu Plasmiden mit hervorragenden Expressionseigenschaften führen. Der Nachteil dieser traditionellen Methoden ist die Durchlaufzeit und die Menge an biologischem Fachwissen, die erforderlich sind, um sie zu konstruieren und zu vermehren. Jüngste Optimierungsbemühungen haben zu einfachen 24-Stunden-Workflows für die Zellextraktaufbereitung47,48 geführt, die parallel zur Energiemixaufbereitung49,50durchgeführt werden können. Das herkömmliche Klonen fügt jedoch dem CFE-Prototyping-Zeitplan mehrere Tage hinzu (Tabelle 1)23. Schnell amplifizierte PCR-Produkte aus dem kommerziellen Genfragment können direkt verwendet werden51, dies begrenzt jedoch die Anzahl der Prototyping-Experimente, da nur 1 μg DNA produziert wird, was etwa fünf Reaktionen entspricht (traditionelle 15 μL-Volumina). Mit diesen zusätzlichen Schritten der Zirkularisierung und isothermen Amplifikation sind größere Mengen als Milligramm der DNA möglich (~5.000 Reaktionen für 1 mg). Dies erhöht die Anzahl der Tests, die im Hochdurchsatz-Screening von Proteinen oder kombinatorischen Enzymnetzwerken (zellfreies Metabolic Engineering) durchgeführt werden können, drastisch; Es ermöglicht auch eine effektive Erhaltung der linearen Template-Bibliothek als hochkonzentrierte DNA. Darüber hinaus wäre eine erhöhte Menge an Vorlagen erforderlich, um größere Mengen an Protein zu prototypisieren, die für materialwissenschaftliche Anwendungen benötigt werden (proteinbasierte Fasern und Hydrogele). Einige Einschränkungen linearer Schablonen können überwunden werden, indem ein Extrakt aus BL21 DE3 Star verwendet wird oder kürzlich entdeckte Methoden verwendet werden, um lineare Schablonen vor Degradation zu schützen52,53,54. Dies betrifft jedoch nicht den begrenzten Bestand an vom Hersteller produzierter DNA für die PCR-Amplifikation oder die Frage des biologischen Fachwissens und der für das Klonen erforderlichen Ausrüstung.

Diese Arbeit stellt ein Protokoll vor, das explizit entwickelt wurde, um die Menge an Expressionsvorlage zu erhöhen, die aus kleinen Mengen von vom Hersteller produzierten Genfragmenten (typischerweise 500-1000 ng lyophilisiertem Pulver) gewonnen werden kann. Die beschriebene Methode erfordert nicht die notwendigen Fähigkeiten, um traditionelles Klonen in Plasmiden oder Transformieren und Vermehren in lebenden Zellen durchzuführen. Nach Erhalt eines Genfragments in der Post kann ein Benutzer genügend Vorlagen für viele zellfreie Reaktionen erstellen, indem er die isotherme Rollkreisamplifikation (RCA) einsetzt (Abbildung 1)23. Während die Menge an DNA, die vom Anbieter erhalten wird, für begrenzte Screening-Bemühungen ausreichen kann, ist sie schnell erschöpft, und der erneute Kauf von Genfragmenten ist zeitaufwendig und kostspielig. Die Methode eignet sich auch besonders gut für Gene, die in E. colitoxisch und schwer zu klonen sind.

Protocol

1. Gestaltung des Genfragments HINWEIS: Das Genfragment sollte alle notwendigen genetischen Elemente für die Transkription/Translation enthalten, einschließlich Promotor, Ribosomenbindungsstelle (RBS), Startcodon, das interessierende Gen und Terminator. Während der Terminator für eine lineare Ausdrucksvorlage (LET) nicht erforderlich ist, ist es wichtig, wenn der Benutzer beschließt, die Sequenz in ein Plasmid einzufügen. Diese Sequenzen wurden aus dem pJL1-sfGFP-Plasmid5…

Representative Results

Die Expression von sfGFP aus RCA-Vorlagen war vergleichbar mit der des pJL1-Plasmids, wenn nur 0,30 μL ungereinigte RCA-DNA in einer 15-μL-Reaktion verwendet wurden (Abbildung 2A). Tatsächlich scheint die Verdoppelung und Verdreifachung der Menge der Vorlage keinen Nutzen im BL21 DE3 Star-Extrakt zu bieten, was auf bereits gesättigte Konzentrationen der Vorlage bei 0,30 μL pro Reaktion hindeutet. Umgekehrt scheint es von Vorteil zu sein, die Menge an RCA-Vorlage zu erhöhen, wenn sie zu…

Discussion

Das Gen von Interesse kann jedes gewünschte Protein sein, aber es ist am besten, mit einem fluoreszierenden Protein als bequemer Reporter für echtzeit- oder endpunkte Auslesung auf einem Well Plate Reader für neue Anwender dieser Methode zu beginnen. Für neue Proteinsequenzen kopieren Sie die Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins und fügen Sie sie in das gewünschte Codon-Optimierungswerkzeug61,62ein. Es gibt normalerweise viele verfügbare Organismen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren erkennen NIH 1R35GM138265-01 und NSF 2029532 für die teilweise Unterstützung dieses Projekts an.

Materials

Alaline Formedium DOC0102
Ammonium glutamate MP Biomedicals MP21805951
Arginine Formedium DOC0106
Asparagine Formedium DOC0114
Aspartic Acid Formedium DOC0118
ATP Sigma A2383
Axygen Sealing Film Corning PCR-SP
CMP Sigma C1006
Coenzyme A Sigma C3144
CutSmart Buffer NEB B7204S Provided with HindIII
Cysteine Formedium DOC0122
DNA Clean and Concentrator Kit Zymo Research D4004 Used for purifying DNA
dNTPs NEB N0447
E. coli tRNA Sigma (Roche) 10109541001
Folinic Acid Sigma 47612
Gene Fragment IDT
Glutamic Acid Formedium DOC0134
Glutamine Formedium DOC0130
Glycine Formedium DOC0138
GMP Sigma G8377
HEPES Sigma H3375
HindIII-HF NEB R3104L
Histidine Formedium DOC0142
Isoleucine Formedium DOC0150
Leucine Formedium DOC0154
Lysine Formedium DOC0158
Magnesium glutamate Sigma 49605
Methionine Formedium DOC0166
Microtiter Plate (384 well) Greiner 781906
Microtiter Plate (96 well) Greiner 655809
Multimode Plate Reader BioTek Synergy Neo2
NAD Sigma N8535
NanoPhotometer Implen NP80
OneTaq DNA Polymerase NEB M0480
PCR Tube VWR 20170-012
Phenylalanine Formedium DOC0170
Phosphoenolpyruvate Sigma (Roche) 10108294
Potassium glutamate Sigma G1501
Potassium oxalate Fisher Scientific P273
Proline Formedium DOC0174
Putrescine Sigma P5780
Serine Formedium DOC0178
Spermidine Sigma S0266
T4 DNA Ligase NEB M0202S
T4 DNA Ligase Reaction Buffer NEB B0202S Provided with T4 DNA Ligase
TempliPhi Amplification Kit Cytiva 25640010 Used for RCA
Thermal Cycler Biorad C1000 Touch
Thermoblock Eppendorf ThermoMixer FP
Threonine Formedium DOC0182
Tryptophan Formedium DOC0186
Tyrosine Formedium DOC0190
UMP Sigma U6375
Valine Formedium DOC0194
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Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems. J. Vis. Exp. (172), e62728, doi:10.3791/62728 (2021).
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