मैक्रोफेज फागोसिटोसिस का मेसेंचिमल स्टेम सेल रेगुलेशन; क्वांटिटेशन और इमेजिंग
Summary
यहां प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल के लिए मात्रा और mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) मैक्रोफेज (MΦ) गैर opsonized खमीर (zymosan) कणों कि एक पीएच संवेदनशील फ्लोरोसेंट अणु के लिए संयुग्मित है की phagocytosis के विनियमन मध्यस्थता की गतिशील छवियों का उत्पादन है ।
Abstract
मेसेंचिमल स्टेम सेल (एमएससी) पारंपरिक रूप से उनके पुनर्योजी गुणों के लिए अध्ययन किया गया है, लेकिन हाल ही में, उनकी इम्यूनोरेगुलेटरी विशेषताएं सबसे आगे रही हैं। वे प्रतिरक्षा कोशिका गतिविधि के साथ बातचीत करते हैं और उन्हें विनियमित करते हैं। इस स्टडी का फोकस एमएससी रेगुलेशन ऑफ मैक्रोफेज फैगोसाइटिक एक्टिविटी है। मैक्रोफेज (MΦ) फैगोसाइटोसिस संक्रमण के लिए जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली प्रतिक्रिया का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है, और जिन तंत्रों के माध्यम से एमएससी इस प्रतिक्रिया को संशोधित करता है, उनकी सक्रिय जांच की जा रही है। यहां प्रस्तुत एमएससी के साथ सह-संस्कृति में, जबकि पीएच-संवेदनशील फ्लोरोसेंट अणु के लिए संयुग्मित गैर-opsonized zymosan कणों के MΦ phagocytosis का अध्ययन करने के लिए एक विधि है । जैसे-जैसे फैगोसाइटिक गतिविधि बढ़ जाती है और लेबल किए गए ज़िमोसन कण फागोलिसोसोम के अम्लीय वातावरण के भीतर संलग्न होते हैं, पीएच-संवेदनशील अणु की फ्लोरेसेंस तीव्रता बढ़ जाती है। उपयुक्त उत्तेजन और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के साथ, फगोसाइटिक गतिविधि को फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके मापा जाता है और गतिज डेटा को 70 मिनट की अवधि में सापेक्ष फ्लोरोसेंट इकाइयों में परिवर्तन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। इस मात्रात्मक डेटा का समर्थन करने के लिए, फागोसाइटिक गतिविधि में परिवर्तन गतिशील इमेजिंग का उपयोग करके कल्पना की जाती है। इस विधि का उपयोग करने वाले परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि जब सह-संस्कृति में, एमएससी भोले और आईएफएन-γ दोनों के गैर-opsonized zymosan के MΦ फागोसिटोसिस को बढ़ाता है MΦ इलाज किया जाता है। ये आंकड़े जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के एमएससी नियमन के वर्तमान ज्ञान को जोड़ते हैं। इस विधि को अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र को पूरी तरह से चित्रित करने के लिए भविष्य की जांच में लागू किया जा सकता है।
Introduction
मेसेंचिमल स्टेम सेल (एमएससी) जनक कोशिकाएं हैं जो संयोजी ऊतक कोशिकाओं को जन्म देती हैं। एमएससी वयस्क स्तनधारी ऊतकों में मौजूद हैं और बोन मैरो1से अलग किया जा सकता है। उनके इम्यूनोमॉडी गुणों के कारण, इन कोशिकाओं का व्यापक रूप से अध्ययन किया जाता है2। टी-सेल3,4,5,6 के एमएससी नियमन पर केंद्रित प्रारंभिक अध्ययन लेकिन हाल ही में, जन्मजात प्रतिरक्षा के एक प्रमुख सेलुलर घटकमैक्रोफेज कोशिकाओं (MΦ) के उनके नियमन पर ध्यान7, 8,9,10,11,12, 13,14प्राप्त हुआहै। . भड़काऊ रोग के उपचार में एमएससी-MΦ इंटरैक्शन के महत्व को इस तथ्य से रेखांकित किया जाता है कि मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज की कमी पशु मॉडल8में एमएससी के चिकित्सीय प्रभावों को समाप्त कर देती है । यहां फोकस एमएससी की सेल कॉन्टैक्ट इंटरैक्शन विद MΦ है। एमएससी में भड़काऊ से लेकर विरोधी भड़काऊ प्रतिक्रियाओं तक स्विच को बढ़ावा देकर MΦ के फेनोटाइप को विनियमित करने की क्षमता है, जिससे ऊतक मरम्मत गतिविधियां8,9,10, 11हो रही हैं और इन नियामक तंत्रों को प्रदर्शित करने के लिए बहुत कुछ किया गया है । अन्य परिस्थितियों में, एमएससी MΦ संचालित भड़काऊ प्रतिक्रिया12, 13 का समर्थन या बढ़ा सकता है और MΦ फागोसाइटिक गतिविधि14,15को बढ़ा सकता है। हालांकि, मौजूदा आंकड़ों की एक महत्वपूर्ण कमी है जो तंत्र की पहचान करती है जिससे और एमएससी MΦ फैगोसाइटिक गतिविधि को विनियमित करती है ।
MΦ रिसेप्टर्स के परिवार होते हैं जो या तो ओपोनाइज्ड (एंटीबॉडी या पूरक लेपित) या गैर-ओपोनाइज्ड रोगजनकों को पहचानते हैं जिससे फैगोसाइटोसिस16 होताहै। बाद की सक्रियता और गतिविधि का अध्ययन कम अच्छी तरह से किया जाता है17. एक गैर-भड़काऊ इन विट्रो वातावरण में, एमएससी गैर-opsonized रोगजनकों के MΦ फागोसिटोसिस को बढ़ाता है13। हालांकि, MΦ द्वारा गैर-ओपोनाइज्ड रोगजनकों की मान्यता एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दौरान लिम्फोसाइट्स द्वारा उत्पादित भड़काऊ वातावरण के संपर्क में आने के बाद कम हो सकती है। प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं और प्रभावक लिम्फोसाइट्स द्वारा जारी आईएफएन-γ, गैर-opsonized कणों के MΦ फागोसिटोसिस पर एक निरोधात्मक प्रभाव पड़ता है18। MΦ फैगोसाइटोसिस के एमएससी डायरेक्ट कॉन्टैक्ट रेगुलेशन के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक सह-संस्कृति मॉडल विकसित किया गया था। यहां प्रस्तुत प्रयोग का लक्ष्य यह निर्धारित करना है कि एमएससी MΦ गैर-opsonized रोगजनकों के phagocytosis को विनियमित करने के बाद MΦ IFN-γ(चित्रा 1)के संपर्क में आ गया है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
पीएच-सेंसिटिव डाई के लिए संयुग्मित जैव-कणों का उपयोग करके फागोसिटोसिस का विश्लेषण एक अपेक्षाकृत नया उपकरण है जो पारंपरिक फ्लोरोसेंटली लेबलवाले कणों12, 19,20पर लाभप्रद साबित हु?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को 1626093 और 1919583 अनुदान संख्या के तहत एनएसएफ मेजर रिसर्च इंस्ट्रूमेंट मैकेनिज्म ने समर्थन दिया था ।
Materials
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
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