Makrofaj Fagositozun Mezenkimal Kök Hücre Regülasyonu; Nicellik ve Görüntüleme
Summary
Burada sunulan, pH’a duyarlı bir floresan moleküle konjuge edilen opsonize olmayan maya (zymosan) parçacıklarının makrofaj (MΦ) fagositozunun mezenkimal kök hücre (MSC) aracılı regülasyonunun dinamik görüntülerini ölçmek ve üretmek için bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
Mezenkimal kök hücreler (MSC) geleneksel olarak rejeneratif özellikleri için çalışılmıştır, ancak daha yakın zamanda immünoregülatör özellikleri ön plandadır. Bağışıklık hücresi aktivitesi ile etkileşime girerler ve düzenlerler. Bu çalışmanın odak noktası makrofaj fagositik aktivitesinin MSC düzenlemesidir. Makrofaj (MΦ) fagositozu, enfeksiyona doğuştan gelen bağışıklık sistemi yanıtının önemli bir parçasıdır ve MSC’nin bu yanıtı modüle ettiği mekanizmalar aktif olarak incelenmektedir. Burada sunulan, MSC ile ortak kültürdeyken pH’a duyarlı bir floresan molekülüne konjuge edilen opsonize olmayan zymosan parçacıklarının MΦ fagositozunu incelemek için bir yöntemdir. Fagositik aktivite arttıkça ve etiketli zymosan parçacıkları fagolyozomların asidik ortamına dahil edildikçe, pH’a duyarlı molekülün floresan yoğunluğu artar. Uygun ekscitasyon ve emisyon dalga boyları ile fagositik aktivite floresan spektrofotometre kullanılarak ölçülür ve kinetik veriler 70 dakikalık bir süre içinde göreceli floresan ünitelerde değişiklik olarak sunulur. Bu nicel verileri desteklemek için, fagositik aktivitedeki değişiklik dinamik görüntüleme kullanılarak görselleştirilir. Bu yöntemi kullanan sonuçlar, ortak kültürde MSC’nin hem naif hem de IFN-γ tedavi edilen MΦ’nin opsonize edilmemiş zymosan’ının MΦ fagositozunu artırdığını göstermektedir. Bu veriler, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin MSC düzenlemesi hakkındaki mevcut bilgi birikimine katkıda bulunur. Bu yöntem, alttaki hücresel ve moleküler mekanizmaları tam olarak tanımlamak için gelecekteki araştırmalarda uygulanabilir.
Introduction
Mezenkimal kök hücreler (MSC) bağ dokusu hücrelerine yol açan progenitör hücrelerdir. MSC yetişkin memeli dokularında bulunur ve kemik iliği1’denizole edilebilir. İmmünomodülatör özellikleri nedeniyle, bu hücreler yaygın olarak incelenir2. T hücrelerinin MSC regülasyonuna odaklanan ilk çalışmalar3,4,5,6, ancak daha yakın zamanda, doğuştan gelen bağışıklığın önemli bir hücresel bileşeni olan makrofaj hücrelerinin (MΦ) düzenlenmesi, 7 , 8 , 9,10,11,12,13,14’ün dikkatini çekmiştir. . Msc-MΦ etkileşiminin enflamatuar hastalığın tedavisindeki önemi, monositlerin / makrofajların tükenmesinin MSC’nin hayvan modellerinde terapötik etkilerini kırdığı gerçeği ile altı çizilmiştir8. Burada, odak noktası MSC’nin MΦ ile hücre teması etkileşimidir. MSC, enflamatuar yanıtlardan antienflamatuar yanıtlara geçişi teşvik ederek MΦ’nin fenotipini düzenleme kapasitesine sahiptir ve doku onarım faaliyetlerine yol açarak 8,9,10,11ve bu düzenleyici mekanizmaları göstermek için çok şey yapılmıştır. Diğer durumlarda, MSC MΦ güdümlü enflamatuar yanıt12,13’ü destekleyebilir veya şiddetlendirebilir ve MΦ fagositik aktivitesiniartırabilir 14,15. Bununla birlikte, MSC’nin MΦ fagositik etkinliğini düzenlediği mekanizmaları ve koşulları tanımlayan kritik bir mevcut veri eksikliği vardır.
MΦ, fenositoza yol açan opsonize (antikor veya tamamlayıcı kaplamalı) veya opsonize olmayan patojenleri tanıyan reseptör ailelerine sahiptir16. İkincisinin aktivasyonu ve aktivitesi daha az iyi çalışılmıştır17. İnflamatuar olmayan bir in vitro ortamda, MSC opsonize olmayan patojenlerin MΦ fagositozunu geliştirir13. Bununla birlikte, uyarlanabilir bir immün yanıt sırasında lenfositler tarafından üretilen enflamatuar bir ortama maruz kaldıktan sonra opsonize olmayan patojenlerin MΦ tarafından tanınması azaltılabilir. Doğal öldürücü hücreler ve efektör lenfositler tarafından salınan IFN-γ, opsonize olmayan parçacıkların MΦ fagositozu üzerinde inhibitör bir etkiye sahiptir18. MSC’nin MΦ fagositozunun doğrudan temas regülasyonunun mekanizmalarını incelemek için bir ortak kültür modeli geliştirilmiştir. Burada sunulan deneyin amacı, MSC’nin MΦ’nin IFN-γ maruz kaldıktan sonra opsonize olmayan patojenlerin MΦ fagositozunu düzenleyip düzenlemediğini belirlemektir (Şekil 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
PH’a duyarlı bir boyaya konjuge edilen biyopartiküller kullanılarak fagositozun analizi, geleneksel floresan etiketli parçacıklara göre avantajlı olduğu kanıtlanmış nispeten yeni bir araçtır12,19,20. Geleneksel floresan etiketli parçacıklarda, sadece uç nokta analizi mümkündür. Tespit, fagosit tarafından alınmamış parçacıkları yıkadıktan veya söndürtükten sonra floresan mikroskopi ve/veya spektrofl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, NSF Büyük Araştırma Aracı mekanizması tarafından hibe sayıları 1626093 ve 1919583 altında desteklendi.
Materials
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
- Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair–current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
- Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
- Giuliani, M., et al. Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation. PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).
- Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).
- Luz-Crawford, P., et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65 (2013).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).
- Nemeth, K., et al. marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).
- Maggini, J., et al. Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile. PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).
- Takizawa, N., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture. Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).
- Kim, J., Hematti, P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).
- Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56 (2015).
- Cho, D. I., et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).
- Fernandez, N., et al. Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response. Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).
- Jackson, M. V., et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS. Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).
- Chaplin, D. D. Overview of the immune response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), 3-23 (2010).
- Lim, J., et al. Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages. Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).
- Wang, Z., et al. Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway. Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).
- Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts. Biotechniques. 68, 245-250 (2020).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Takahashi, D., et al. Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE. Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).
