تنظيم الخلايا الجذعية Mesenchymal من البلعم البلعمي; الكمية والتصوير
Summary
يقدم هنا بروتوكول لتحديد وإنتاج صور ديناميكية للخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) لتنظيم البلعمة الضامة (MΦ) من جزيئات الخميرة غير opsonized (zymosan) التي يتم اقترانها بجزيء فلوري حساس ل درجة الحموضة.
Abstract
تمت دراسة الخلايا الجذعية الميزنشيمالية (MSC) تقليديا لخصائصها التجديدية ، ولكن في الآونة الأخيرة ، كانت خصائصها المناعية في المقدمة. وهي تتفاعل مع نشاط الخلايا المناعية وتنظمه. ينصب تركيز هذه الدراسة على تنظيم MSC للنشاط البلعوي الضام. الضامة (MΦ) البلعومي هو جزء مهم من استجابة الجهاز المناعي الفطرية للعدوى ، والآليات التي من خلالها تعدل MSC هذه الاستجابة قيد التحقيق النشط. هنا هو وسيلة لدراسة MΦ phagocytosis من الجسيمات غير opsonized zymosan المقترنة جزيء الفلورسنت الحساسة ل درجة الحموضة بينما في الثقافة المشتركة مع MSC. مع زيادة النشاط البلعوسي وانسداد جزيئات الزيموسان المسماة داخل البيئة الحمضية للفسوسوم ، تزداد كثافة الفلورية للجزيء الحساس ل درجة الحموضة. مع الإثارة المناسبة والأطوال الموجية للانبعاثات ، يتم قياس النشاط البلعوسي باستخدام مطياف فلوري ويتم تقديم البيانات الحركية كتغيرات في وحدات الفلورسنت النسبية على مدى فترة 70 دقيقة. ولدعم هذه البيانات الكمية، يتم تصور التغير في النشاط البلعوي باستخدام التصوير الديناميكي. تظهر النتائج باستخدام هذه الطريقة أنه عندما تكون في الثقافة المشتركة ، تعزز MSC الفوسفات MΦ من zymosan غير opsonized من كل من السذاجة وIFN-γ تعامل MΦ. هذه البيانات إضافة إلى المعرفة الحالية لتنظيم MSC من الجهاز المناعي الفطري. ويمكن تطبيق هذه الطريقة في التحقيقات المستقبلية لتحديد الآليات الخلوية والجزيئية الأساسية بشكل كامل.
Introduction
الخلايا الجذعية الميكنشيمالية (MSC) هي خلايا سلفية تؤدي إلى خلايا النسيج الضام. MSC موجودة في أنسجة الثدييات الكبار ويمكن عزلها عن نخاع العظام1. بسبب خصائصها المناعية ، تتم دراسة هذه الخلايا على نطاق واسع2. الدراسات المبكرة التي ركزت على تنظيم MSC من الخلايا التائية3،4،5،6 ولكن في الآونة الأخيرة ، وتنظيمها للخلايا الضامة (MΦ) ، وهو عنصر خلوي رئيسي من الحصانة الفطرية ، وقد تلقت اهتماما متزايدا7،8،9،10،11،12،13،14 . أهمية التفاعل MSC-MΦ في علاج مرض التهابي يؤكده حقيقة أن استنفاد monocytes / الضامة يلغي الآثار العلاجية للMSC في النماذج الحيوانية8. هنا، التركيز هو تفاعل اتصال الخلية من MSC مع MΦ. MSC لديها القدرة على تنظيم النمط الظاهري من MΦ من خلال تعزيز التحول من الاستجابات الالتهابية إلى المضادة للالتهابات، مما يؤدي إلى أنشطة إصلاح الأنسجة8،9،10،11، وقد تم القيام بالكثير لإثبات هذه الآليات التنظيمية. في ظل ظروف أخرى، يمكن أن تدعم MSC أو تفاقم استجابة التهابية مدفوعة MΦ12،13 وتعزيز النشاط البلعوي MΦ14،15. ومع ذلك، هناك نقص خطير في البيانات الموجودة التي تحدد الآليات التي بموجبها والظروف التي تنظم MSC النشاط البلعوي MΦ.
MΦ لديها عائلات المستقبلات التي تعترف إما opsonized (الأجسام المضادة أو تكمل المغلفة) أو مسببات الأمراض غير opsonized مما يؤدي إلى البلعوم16. تفعيل ونشاط هذا الأخير هو أقل دراسة جيدة17. في بيئة غير التهابية في المختبر ، تعزز MSC الفوسفات MΦ من مسببات الأمراض غير opsonized13. ومع ذلك ، يمكن تقليل التعرف على مسببات الأمراض غير opsonized بواسطة MΦ بعد التعرض لبيئة التهابية تنتجها الخلايا الليمفاوية أثناء الاستجابة المناعية التكيفية. IFN-γ، التي أطلقتها الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا الليمفاوية التأثير، له تأثير مثبط على MΦ البلعوم من الجسيمات غير opsonized18. تم تطوير نموذج الثقافة المشتركة لدراسة آليات تنظيم الاتصال المباشر MSC من البلعوس MΦ. الهدف من التجربة المعروضة هنا هو تحديد ما إذا كان MSC ينظم MΦ phagocytosis من مسببات الأمراض غير opsonized بعد MΦ قد تعرضت لIFN-γ (الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
تحليل البلعوس باستخدام الجسيمات الحيوية المترافقة مع صبغة حساسة ل درجة الحموضة هو أداة جديدة نسبيا التي أثبتت جدواها على الجسيمات التقليدية المسمى الفلورسنت12،19،20. مع الجسيمات التقليدية ذات العلامات الفلورية ، لا يمكن إجراء سوى تحليل ن?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل آلية أداة البحوث الرئيسية التابعة ل NSF في إطار أعداد المنح 1626093 1919583.
Materials
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
- Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair–current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
- Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
- Giuliani, M., et al. Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation. PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).
- Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).
- Luz-Crawford, P., et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65 (2013).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).
- Nemeth, K., et al. marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).
- Maggini, J., et al. Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile. PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).
- Takizawa, N., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture. Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).
- Kim, J., Hematti, P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).
- Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56 (2015).
- Cho, D. I., et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).
- Fernandez, N., et al. Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response. Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).
- Jackson, M. V., et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS. Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).
- Chaplin, D. D. Overview of the immune response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), 3-23 (2010).
- Lim, J., et al. Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages. Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).
- Wang, Z., et al. Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway. Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).
- Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts. Biotechniques. 68, 245-250 (2020).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Takahashi, D., et al. Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE. Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).
