Mesenchymale stamcelregulatie van macrofaagfagocytose; Kwantificering en beeldvorming
Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd om dynamische beelden van mesenchymale stamcel (MSC) gemedieerde regulatie van macrofaag (MΦ) fagocytose van niet-opsonized gist (zymosan) deeltjes die zijn geconjugeerd aan een pH-gevoelig fluorescerend molecuul te kwantificeren en te produceren.
Abstract
Mesenchymale stamcellen (MSC) zijn traditioneel bestudeerd voor hun regeneratieve eigenschappen, maar meer recentelijk hebben hun immunoregulerende kenmerken op de voorgrond gestaan. Ze interageren met en reguleren de activiteit van immuuncellen. De focus van deze studie ligt op de MSC-regulatie van macrofaag fagocytische activiteit. Macrofaag (MΦ) fagocytose is een belangrijk onderdeel van de aangeboren reactie van het immuunsysteem op infectie, en de mechanismen waarmee MSC deze respons moduleert, worden actief onderzocht. Hier wordt een methode gepresenteerd om MΦ-fagocytose van niet-opsonized zymosan-deeltjes geconjugeerd aan een pH-gevoelig fluorescerend molecuul te bestuderen terwijl ze in co-cultuur met MSC zijn. Naarmate de fagocytische activiteit toeneemt en de gelabelde zymosandeeltjes worden ingesloten in de zure omgeving van het fagolysosoom, neemt de fluorescentie-intensiteit van het pH-gevoelige molecuul toe. Met de juiste excitatie- en emissiegolflengten wordt fagocytische activiteit gemeten met behulp van een fluorescerende spectrofotometer en worden kinetische gegevens gepresenteerd als veranderingen in relatieve fluorescerende eenheden gedurende een periode van 70 minuten. Om deze kwantitatieve gegevens te ondersteunen, wordt de verandering in de fagocytische activiteit gevisualiseerd met behulp van dynamische beeldvorming. Resultaten met behulp van deze methode tonen aan dat MSC in co-cultuur MΦ fagocytose van niet-opsonized zymosan van zowel naïeve als IFN-γ behandelde MΦ verbetert. Deze gegevens dragen bij aan de huidige kennis van MSC-regulatie van het aangeboren immuunsysteem. Deze methode kan worden toegepast in toekomstig onderzoek om de onderliggende cellulaire en moleculaire mechanismen volledig af te bakenen.
Introduction
Mesenchymale stamcellen (MSC) zijn voorlopercellen die aanleiding geven tot bindweefselcellen. MSC zijn aanwezig in volwassen zoogdierweefsels en kunnen worden geïsoleerd uit het beenmerg1. Vanwege hun immunomodulerende eigenschappen worden deze cellen op grote schaal bestudeerd2. Vroege studies richtten zich op MSC-regulatie van T-cellen3,4,5,6, maar meer recent heeft hun regulatie van macrofaagcellen (MΦ), een belangrijke cellulaire component van aangeboren immuniteit, meer aandacht gekregen7,8,9,10,11,12,13,14 . Het belang van MSC-MΦ-interactie bij de behandeling van ontstekingsziekten wordt onderstreept door het feit dat uitputting van monocyten / macrofagen de therapeutische effecten van MSC in diermodellenopheft 8. Hier ligt de focus op de celcontactinteractie van de MSC met MΦ. MSC heeft de capaciteit om het fenotype van MΦ te reguleren door de overgang van inflammatoire naar ontstekingsremmende reacties te bevorderen, wat leidt tot weefselherstelactiviteiten8,9,10,11,en er is veel gedaan om deze regulerende mechanismen aan te tonen. Onder andere omstandigheden kan MSC een door MΦ aangedreven ontstekingsreactie12, 13 ondersteunen of verergeren en de fagocytische activiteit van MΦverbeteren 14,15. Er is echter een kritiek gebrek aan bestaande gegevens die de mechanismen identificeren waarbij en de omstandigheden waaronder MSC de fagocytische activiteit van MΦ reguleert.
MΦ hebben families van receptoren die ofwel opsonized (antilichaam of complement gecoat) of niet-opsonized pathogenen herkennen die leiden tot fagocytose16. De activering en activiteit van de laatste is minder goed bestudeerd17. In een niet-inflammatoire in vitro omgeving verbetert MSC MΦ fagocytose van niet-opsonized pathogenen13. Herkenning van niet-opsonized pathogenen door MΦ kan echter worden verminderd na blootstelling aan een inflammatoire omgeving geproduceerd door lymfocyten tijdens een adaptieve immuunrespons. IFN-γ, vrijgegeven door natural killer cellen en effector lymfocyten, heeft een remmend effect op MΦ fagocytose van niet-opsonized deeltjes18. Een co-cultuurmodel werd ontwikkeld om de mechanismen van MSC directe contactregulatie van MΦ fagocytose te bestuderen. Het doel van het hier gepresenteerde experiment is om te bepalen of MSC MΦ fagocytose van niet-opsonized pathogenen reguleert nadat MΦ zijn blootgesteld aan IFN-γ (Figuur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Analyse van fagocytose met behulp van biodeeltjes geconjugeerd tot een pH-gevoelige kleurstof is een relatief nieuw hulpmiddel dat voordelig is gebleken ten opzichte van traditionele fluorescerend gelabelde deeltjes12,19,20. Met traditionele fluorescerend gelabelde deeltjes is alleen eindpuntanalyse mogelijk. Detectie wordt uitgevoerd met fluorescerende microscopie en/of spectrofluormetrie na het wassen of blussen van deeltjes d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het NSF Major Research Instrument-mechanisme onder subsidienummers 1626093 en 1919583.
Materials
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
- Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair–current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
- Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
- Giuliani, M., et al. Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation. PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).
- Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).
- Luz-Crawford, P., et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65 (2013).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).
- Nemeth, K., et al. marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).
- Maggini, J., et al. Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile. PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).
- Takizawa, N., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture. Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).
- Kim, J., Hematti, P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).
- Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56 (2015).
- Cho, D. I., et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).
- Fernandez, N., et al. Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response. Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).
- Jackson, M. V., et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS. Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).
- Chaplin, D. D. Overview of the immune response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), 3-23 (2010).
- Lim, J., et al. Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages. Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).
- Wang, Z., et al. Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway. Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).
- Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts. Biotechniques. 68, 245-250 (2020).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Takahashi, D., et al. Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE. Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).
