Måling av pH, redokskjemier og nedbrytende kapasitet for makropinosomer ved hjelp av dual-fluorofor ratiometrisk mikroskopi
Summary
Vi beskriver protokoller for måling av pH, oksidative hendelser og proteinfordøyelse i individuelle makropinosomer i levende celler. Det legges vekt på metrisk mikroskopi med dobbel fluorofor og fordelene ved populasjonsbaserte teknikker.
Abstract
I de senere år har feltet makropinocytose vokst raskt. Makropinocytose har dukket opp som en sentral mekanisme der medfødte immunceller opprettholder organismal homeostase og immunitet. Samtidig, og i motsetning til sin homeostatiske rolle, kan den også drive ulike patologier, inkludert kreft og virusinfeksjoner. I motsetning til andre moduser for endokytose forblir verktøyene utviklet for å studere modning av makropinosomer underutviklet. Her beskriver protokollen nyutviklede verktøy for å studere redoksmiljøet i lumen av tidlige og modne makropinosomer. Metoder for bruk av ratiometrisk fluorescensmikroskopi i vurderingen av pH, produksjon av reaktive oksygenarter og nedbrytningskapasiteten i lumen av individuelle makropinosomer i levende celler er beskrevet. Enkle organelle målinger gir fordelen av å avsløre romlig heterogenitet, som ofte går tapt med befolkningsbaserte tilnærminger. Det legges vekt på de grunnleggende prinsippene for dobbel fluoroforeringsmålingsmikroskopi, inkludert sondevalg, instrumentering, kalibrering og encellede versus populasjonsbaserte metoder.
Introduction
Makropinocytose refererer til opptaket av store mengder ekstracellulær væske i membranbundne cytoplasmiske organeller kalt makropinosomer1,2. Det er en svært bevart prosess utført av frittlevende encellede organismer, for eksempel amoeba Dictyostelium spp. 3, samt anthozoans4 og metazoans2. I de fleste celler er makropinocytose en indusert hendelse. Ligasjonen av celleoverflatereseptorer induserer fremspringet av aktindrevne plasmamembranforlengelser referert til som ruffles. En brøkdel av disse ruffles, av noen dårlig forstått mekanisme, forsegle på sine distale tips for å danne makropinosomer (men utover omfanget av dette metodepapiret, for detaljerte vurderinger av makropinocytosemekanikken, vennligst se referanse1,2,5,6,7). Den ekstracellulære stimulansen som induserer makropinocytose er oftest en løselig vekstfaktor5,8. Følgelig tillater den makropinocytiske hendelsen inntak av en bolus av ekstracellulært materiale som cellen kan utlede nyttige metabolitter for å lette veksten. Dessverre kan denne veien for næringslevering også drive patologi. Visse kreftceller har mutasjoner som resulterer i kontinuerlig eller konstituerende makropinocytose. Kontinuerlig levering av næringsstoffer letter ukontrollert spredning av kreftceller og har vært knyttet til spesielt aggressive svulster9,10,11,12,13. På samme måte kan virus indusere makropinocytose for å få tilgang til vertsceller, og dermed drive viral patologi14.
Macropinocytose fungerer også i vedlikehold av immunitet mot patogener. Visse medfødte immunceller som makrofager og dendrittiske celler engasjerer seg i konstituerende og aggressiv prøvetaking av ekstracellulær væske via makropinocytose6,15,16. Denne modusen for makropinocytose er utrolig aktiv, og en enkelt dendrittisk celle kan engorge seg med et volum ekstracellulær væske som tilsvarer sin egen vekt hver time17. Til tross for denne konstituerende prøvetakingen, replikerer ikke makrofager og dendrittiske celler ukontrollert som tumorceller, i stedet ser de ut til å behandle det ekstracellulære materialet på en slik måte at informasjon kan trekkes ut for å informere om tilstedeværelsen, eller faktisk fravær, av potensielle trusler. Informasjon ekstraheres som i) patogen-assosierte molekylære mønstre som kan leses av intracellulære patogengjenkjenningsreseptorer og ii) korte strekninger av aminosyrer som kan lastes på store histokompatibilitetsmolekyler for screening av celler i det adaptive immunsystemet16,18,19. Hvorvidt patogener undergraver denne banen for informasjonsbehandling av immunceller er for tiden uklart.
Til tross for disse veldefinerte og kritiske rollene for makropinocytose i både vedlikehold av immunitet og homeostase og i motsetning til andre mer ofte studerte moduser for endokytose, er lite av de indre (luminale) arbeidene til makropinosomer kjent. Å utvikle standardiserte protokoller og verktøy for å studere makropinosomenes lysende biokjemi vil ikke bare hjelpe oss med å forstå deres unike biologi bedre, men vil gi innsikt som kan utnyttes for nye terapeutiske strategier, inkludert legemiddellevering20. Dette metodemanuskriptet vil fokusere på nylig utviklede verktøy for å dissekere, på enkelt organellnivå, ulike aspekter av lysende biokjemi av makropinosomer.
Fluoroforer kan brukes til å måle spesifikke biokjemier av organeller hvis i) de partisjonerer fortrinnsvis inn i rommet av interesse og / eller ii) de gjennomgår spektralendringer som svar på interesseparameteren. For eksempel, når det gjelder pH, akkumuleres fluorescerende svake baser, som acridine oransje, cresylfiolett og LysoTracker-fargestoffer fortrinnsvis i sure organeller. Derfor er deres relative intensitet en grov indikasjon på at den merkede organellen er sur. Andre pH-responsive fluoroforer, som fluorescein, pHrodo og cypHer5e, gjennomgår spektralendringer ved binding til protoner (Figur 1A–C). Endringer i fluorescensutslippet av pH-sensitive fluoroforer kan derfor gi en nyttig tilnærming av pH. Bruken av enkle fluoroforer presenterer imidlertid en rekke ulemper. For eksempel kan endringer i fokusplanet, fotobleaching og endringer i volumet av individuelle organeller, en vanlig forekomst i makropinosomer21, indusere endringer i fluorescensintensiteten til enkle fluoroforer, og dette kan ikke lett korrigeres for22. Enkeltbølgelengdevurderinger, selv om de er nyttige for visualisering av sure rom, er derfor rent kvalitative.
En mer kvantitativ tilnærming er å målrette den parameterfølsomme fluoroforen sammen med en referansefluoreor til organell av interesse. Referansen fluorofor er ideelt ufølsom for biokjemiske endringer i organellen (Figur 1D–F) og kan derfor brukes til å korrigere for endringer i fokusplanet, organellarvolumet og til en viss grad fotobleking23. Ved hjelp av denne tilnærmingen, referert til som dual-fluorophore ratiometric fluorescence, kan korreksjon oppnås ved å generere et forhold mellom fluorescensutslippet av den parameterfølsomme fluoroforen til referansefluorefoforen.
Her vil protokollen bruke prinsippet om dual-fluorophore ratiometric imaging for å måle pH, oksidative hendelser og proteinforringelse innen makropinosomer. I hvert tilfelle vil en fluorofor bli valgt som er følsom for interesseparameteren og en referansefluorefor. For å målrette fluoroforene spesielt mot makropinosomer, vil de bli kovalent koblet til 70 kDa dextran, som fortrinnsvis er innlemmet i makropinosomer24. Alle analyser vil bli utført i Raw264.7 celler, men kan tilpasses andre celletyper. Der det er mulig, vil fluorescensforholdene kalibreres mot en referansekurve for å få absolutte verdier. Det er viktig at alle målinger utføres i levende celler for dynamisk og kvantitativ vurdering av lysstyrkemiljøet til makropinosomer.
Ved valg av pH-sensitive fluoroforer må en rekke hensyn veies. Den første er pKa av fluoroforen, som indikerer rekkevidden av pH-verdier der sonden vil være mest følsom. Hvis det antas at kort tid etter dannelsen vil makropinosomets pH være nær det ekstracellulære mediet (~ pH 7.2), og at det gradvis vil surne gjennom interaksjoner med sene endosomer og lysosomer (~ pH 5.0), bør en sonde med en pKa som er følsom innenfor dette området (Figur 2C) velges. Fluoroforfluorecein, som har en pKa på 6,4, er optimalt følsom innenfor det området. Det har blitt brukt mye for å måle andre lignende organeller, som fagosomer, og vil være den valgte fluoroforen i dette manuskriptet22,25. Som referanse fluorofor vil tetrametylrhodamin bli brukt, noe som er ufølsomt for pH (Figur 1E). Andre fluoroforer, som pHrodo og cypHer5e, kan erstattes av fluorescein der spektralegenskapene til fluorescein samsvarer med andre eksperimentelle variabler. Noen foreslåtte referansefluoreforer for pHrodo og cypHer5e er vist i figur 1.
En annen vurdering er metoden der de to fluoroforene vil bli målrettet spesielt mot makropinosomer. Dextran av størrelsen 70 kDa, som har en hydrodynamisk radius på omtrent 7 nm, holder seg ikke spesielt til celler og er innlemmet i makropinosomer, men ikke klarrinbelagte groper eller caveolae, og markerer derfor makropinosomer (Figur 2A og Figur 3A, B)16,24,26. I denne protokollen vil fluorescein-merket 70 kDa dextran og tetrametylrhodamin (TMR)-merket 70 kDa dextran bli brukt som henholdsvis pH-sensitive og referansesonder.
I medfødte immunceller representerer makropinocytose og fagocytose de to store rutene for internalisering av eksogent materiale for behandling og etterfølgende presentasjon til celler i adaptiv immunrespons27. Den forsiktige og koordinerte kontrollen av redokskjemien til lumen av fagosomer og makropinosomer er avgjørende for kontekstspesifikk behandling av eksogent materiale. Kanskje den mest studerte regulatoren av oksidative hendelser i fagosomer er NADPH oksidase, et stort multi-subenhetskompleks som produserer store mengder reaktive oksygenarter (ROS) innen lumen av fagosomer28. Faktisk er aktiviteten sentral for passende antigenbehandling innen fagosomer29,30. Likevel har aktiviteten til NADPH-oksidasen på makropinosomale membraner ikke blitt utforsket.
I denne protokollen brukes H2DCFDA succinimidyl ester til måling av oksidative hendelser i makropinosomet. Dette er en modifisert form for fluorescein (2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate), som er minimalt fluoresccent i sin reduserte form. Ved oksidasjon øker fluorescensutslippet betydelig. Det er imidlertid verdt å merke seg en betydelig advarsel om H2DCFDA – som det er basert på fluorofor fluorescein, er fluorescensen også slokket i sure rom, og det må tas hensyn til å kontrollere for denne variabelen når du designer eksperimenter28. I likhet med tilnærmingen for måling av pH, vil H2DCFDA succinimidylsteren festes kovalent til 70 kDa dextran og TMR-merket 70 kDa dextran vil bli brukt som referansefluorefofor (figur 3A).
Fluorescerende ovalbumin vil bli brukt til å måle proteinforringelse innen makropinosomer. Ovalbumin som brukes her er tett merket med en 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) FL fargestoff som er selvslukket. Ved fordøyelsen frigjøres sterkt fluorescerende fargestoffmerkede peptider. Siden ovalbumin ikke lett kan konjugeres til 70 kDa dextran, vil celler med TMR-merket 70 kDa dextran og væskefase ovalbumin bli co-inkubert. TMR-signalet vil bli brukt til å generere en makropinosommaske under postavbildningsanalyse, og signalet frigjort fra det fordøyde ovalbuminet måles i masken (Figur 3B).
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om det finnes en rekke protokoller for både lave og høye gjennomstrømningsmålinger av makropinocytisk opptak i makrofager, fibroblaster og til og med Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33, svært få forsøk er gjort for å måle lysbiokjemien til disse dynamiske rommene. Dette skyldes sannsynligvis en paucity av sonder som effektivt kan målrettes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Universitetet i Calgary for støtten. Vi vil også takke Dr. Robin Yates for tilgang til reagenser, utstyr og nyttige diskusjoner.
Materials
| Black-walled 96 well plate | PerkinElmer | 6005430 | |
| CypHer5e, NHS ester | Cytiva | PA15401 | |
| Dextran-amino 70 kDa | Invitrogen | D1862 | |
| DQ-ovalbumin | Invitrogen | D12053 | |
| FITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1823 | |
| HBSS | Gibco | 14287 | |
| Nigericin | Sigma Aldrich | N7143 | |
| OxyBurst Green-SE | Invitrogen | D2935 | |
| pHrodo Red, SE | Invitrogen | P36600 | |
| Raw264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI medium | Gibco | 11875093 | |
| SP5 Confocal Microscope | Leica | – | |
| TRITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1819 | |
| u-Dish | Ibidi | 81156 |
References
- Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. SnapShot: Macropinocytosis. Cell. 169, 766 (2017).
- Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).
- Ganot, P., et al. Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans. eLife. 50022, (2020).
- Charpentier, J. C., et al. Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1. Nature Communications. 11, 180 (2020).
- Bohdanowicz, M., et al. Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes. Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).
- Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).
- Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131, (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
- Commisso, C. The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153 (2019).
- Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. , (2021).
- Lee, S. -. W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).
- Michalopoulou, E., et al. Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition. Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).
- Mercer, J., Helenius, A. Virus entry by macropinocytosis. Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305, 1153-1157 (2004).
- Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284 (2016).
- Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).
- Bhosle, V. K., et al. SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling. Nature Communications. 11, 4112 (2020).
- Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
- Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance. Science. 367, 301-305 (2020).
- Canton, J., Grinstein, S. Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1519, 185-199 (2017).
- Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging. Methods Molecular Biology. 1519, 227-239 (2017).
- Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
- Canton, J., Grinstein, S. Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).
- Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation. Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual Reviews of Immunology. 31, 443-473 (2013).
- Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).
- Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112, 4712-4722 (2008).
- Canton, J., et al. The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens. Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).
- Mishra, R., Bhowmick, N. A. Visualization of macropinocytosis in prostate fibroblasts. Bio-Protocol. 9, (2019).
- Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. Quantitation of macropinocytosis in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1928, 113-123 (2019).
- Lee, S. -. W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).
- Swanson, J. A., King, J. S. The breadth of macropinocytosis research. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180146 (2019).
