Den isolerede kanin lunge forberedelse er en guld standard værktøj i lungeforskning. Denne publikation har til formål at beskrive den teknik, der er udviklet til undersøgelse af fysiologiske og patologiske mekanismer, der er involveret i luftvejsreaktivitet, lungebevarelse og præklinisk forskning i lungetransplantation og lungeødem.
Det isolerede lungeperfusionssystem har været meget udbredt i lungeforskning, hvilket bidrager til at belyse lungernes indre funktioner, både mikro- og makroskopisk. Denne teknik er nyttig i karakteriseringen af lungefysiologi og patologi ved at måle metaboliske aktiviteter og åndedrætsfunktioner, herunder interaktioner mellem kredsløbsstoffer og virkningerne af inhalerede eller perfunderede stoffer, som i lægemiddeltest. Mens in vitro-metoder involverer udskæring og dyrkning af væv, gør det isolerede ex vivo lungeperfusionssystem det muligt at arbejde med et komplet funktionelt organ, der muliggør studiet af en kontinuerlig fysiologisk funktion, samtidig med at ventilation og perfusion genoprettes. Det skal dog bemærkes, at virkningerne af fraværet af central innervation og lymfedrænage stadig skal vurderes fuldt ud. Denne protokol har til formål at beskrive samlingen af det isolerede lungeapparat, efterfulgt af kirurgisk ekstraktion og cannulation af lunger og hjerte fra eksperimentelle forsøgsdyr, samt at vise perfusionsteknikken og signalbehandlingen af data. Den gennemsnitlige levedygtighed af den isolerede lunge varierer mellem 5-8 timer; i denne periode øges lungekapillær permeabiliteten, hvilket forårsager ødem- og lungeskader. Funktionaliteten af konserveret lungevæv måles ved kapillær filtreringskoefficient (Kfc), der anvendes til at bestemme omfanget af lungeødem gennem tiden.
Brodie og Dixon beskrev først ex-vivo lungeperfusionssystemet i 1903 1. Siden da er det blevet et guldstandardværktøj til at studere lungernes fysiologi, farmakologi, toksikologi og biokemi2,3. Teknikken tilbyder en konsekvent og reproducerbar måde at vurdere levedygtigheden af lungetransplantationer, og at bestemme effekten af inflammatoriske mæglere såsom histamin, arachidonsyre metabolitter, og stof P, blandt andre, samt deres interaktioner under lungefænomener såsom bronchoconstriction, atelektase, og lungeødem. Det isolerede lungesystem har været en nøgleteknik til at afsløre lungernes vigtige rolle i elimineringen af biogene aminer fra den generelle cirkulation4,5. Derudover er systemet blevet brugt til at evaluere biokemien af lungebrændingsmiddel6. I løbet af de sidste par årtier er ex-vivo lungeperfusionssystemet blevet en ideel platform for lungetransplantationsforskning7. I 2001 beskrev et hold ledet af Stig Steen den første kliniske anvendelse af ex-vivo lungeperfusionssystemet ved at bruge det til at istandsætte lungerne hos en 19-årig donor, som oprindeligt blev afvist af transplantationscentre på grund af dets skader. Den venstre lunge blev høstet og perfunderet i 65 min; Efterfølgende blev det med succes transplanteret ind i en 70-årig mand med KOL8. Yderligere forskning i lunge istandsættelse ved hjælp af ex-vivo perfusion førte til udvikling af Toronto teknik til udvidet lunge perfusion til at vurdere og behandle sårede donor lunger9,10. Klinisk har ex-vivo lungeperfusionssystemet vist sig at være en sikker strategi for at øge donorpuljer ved at behandle og istandsætte donor lunger, der ikke lever op til standarddonor lunger, hvilket ikke udgør nogen signifikant forskel i risici eller resultater i forhold til standardkriterier donorer10.
Den største fordel ved det isolerede lungeperfusionssystem er, at de eksperimentelle parametre kan evalueres i et komplet funktionelt organ, der bevarer dets fysiologiske funktion under en kunstig laboratorieopsætning. Desuden gør det muligt at måle og manipulere lungemekanisk ventilation for at analysere komponenterne i lungefysiologi som luftvejsmodstand, total vaskulær modstand, gasudveksling og ødemdannelse, som til dato ikke kan måles præcist in vivo på forsøgsdyr2. Navnlig kan sammensætningen af den opløsning, hvormed lungen er gennemsyret, kontrolleres fuldt ud, hvilket gør det muligt at tilsætning af stoffer til at evaluere deres virkninger i realtid og prøveindsamling fra perfusion til yderligere undersøgelse11. Forskere, der arbejder med det isolerede lungesystem, bør huske på, at mekanisk ventilation forårsager henfald af lungevævet, der forkorter dets nyttige tid. Dette progressive fald i mekaniske parametre kan betydeligt forsinkes ved hyperinflatering af lungerne lejlighedsvis i løbet af eksperimentets tid4. Alligevel kan præparatet normalt ikke vare mere end otte timer. En anden overvejelse for ex-vivo lunge perfusion system er fraværet af centralnervesystemet regulering og lymfedrænage. Virkningerne af deres fravær er endnu ikke fuldt forstået og kan potentielt være en kilde til bias i visse eksperimenter.
Den isolerede lungeperfusionssystemteknik kan udføres i kaninmodellen med en høj grad af konsistens og reproducerbarhed. Dette arbejde beskriver de tekniske og kirurgiske procedurer for gennemførelsen af ex-vivo isolerede lungeperfusion teknik som udviklet til kanin model på Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias i Mexico City, der har til hensigt at dele indsigt og give en klar vejledning om centrale trin i anvendelsen af denne eksperimentelle model.
Dette arbejde viser et generelt billede af den isolerede lunge perfusion system, en væsentlig teknik i lungefysiologi forskning. Det isolerede lungeperfusionssystem giver en stor grad af alsidighed i dets anvendelser og gør det muligt at evaluere flere parametre, der er relevante i testningen af en bred vifte af hypoteser15. Et isoleret lungesystem er et værktøj med verdensomspændende tilstedeværelse, der i det sidste årti yderligere har fastslået sin relevans for organspecifikke evaluerin…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Ph.D. Bettina Sommer Cervantes for hendes støtte i skrivning af dette manuskript, og Kitzia Elena Lara Safont for hendes støtte med illustrationerne.
2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1864 | |
Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4309 | |
Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4138 | |
Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder | sigma | 3912 | 500 g |
Calcium chloride, CaCl2·2H2O. | JT Baker | 10035-04-8 | |
Cryogenic vials | Corning | 430659 | 2 mL |
D-glucosa, C6H12O6. | sigma | G5767 | |
Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-3882 | |
Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0064 | |
Eppendorf tubes | |||
Ethanol absolute HPLC grade | Caledon | ||
Falcon tubes | 14 mL | ||
Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 70-7001 | |
Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9349 | |
Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9703 | |
Heparin | PISA | 5000 UI | |
HPLC Column (C18 100A 5U) | Alltech | 98121213 | 150 mm x 4.6 mm |
Hydrophilic Syringe Filter | Millex | SLLGR04NL | 4 mm |
IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0322 | |
Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0125 | |
Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4162 | |
Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0020 | |
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O | JT Baker | 10034-99-8 | |
Microcentrifuge Tube | Corning | 430909 | |
Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4298 | |
New Zeland rabbits | |||
PISABENTAL (Pentobarbital sodium) | PISA | Q-7833-215 | |
PLUGSYS Case, Type 603* 7 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0045 | |
PLUGSYS TCM Time Counter Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1750 | |
PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0065 | |
PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1793 | |
PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1755 | |
Potassium chloride, KCl. | JT Baker | 3040-01 | |
Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 7778-77-0 | |
PROCIN (Xylacine clorhydrate) | PISA | Q-7833-099 | |
Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4161 | |
Scalpel knife | |||
Serotonin 5-HT | |||
Servo Controller for Perfusion (SCP | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-2806 | |
Snap Cap Microcentrifuge Tube | Costar | 3620 | 1.7 mL |
Sodium bicarbonate, NaHCO3 | sigma | S6014 | |
Sodium chloride, NaCl. | sigma | S9888 | |
Surgical gloves No. 7 1/2 | |||
Surgical gloves No. 8 | |||
Taygon tubes | Masterflex | ||
Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4163 |