Tavşan Modelinde İzole Akciğer Perfüzyon Sistemi
Summary
İzole tavşan akciğer hazırlığı pulmoner araştırmalarda altın standart bir araçtır. Bu yayın, tekniğin hava yolu reaktivitesi, akciğerin korunması ve akciğer nakli ve pulmoner ödemde preklinik araştırmalarda yer alan fizyolojik ve patolojik mekanizmaların incelenmesi için geliştirilmiş olarak tanımlanmaktadır.
Abstract
İzole akciğer perfüzyon sistemi pulmoner araştırmalarda yaygın olarak kullanılmış ve akciğerlerin iç işleyişini hem mikro hem de makroskopik olarak aydınlatmaya katkıda bulunmaktadır. Bu teknik, ilaç testinde olduğu gibi dolaşım maddeleri arasındaki etkileşimler ve solunan veya perfüzyonlu maddelerin etkileri de dahil olmak üzere metabolik aktiviteleri ve solunum fonksiyonlarını ölçerek pulmoner fizyoloji ve patolojinin karakterizasyonunda yararlıdır. İn vitro yöntemler dokuların dilimlenerek kültünü içerirken, izole ex vivo akciğer perfüzyon sistemi, havalandırma ve perfüzyonu yeniden canlandırırken sürekli fizyolojik bir fonksiyonun çalışmasını mümkün kılması için eksiksiz bir fonksiyonel organla çalışmaya izin verir. Bununla birlikte, merkezi innervasyon ve lenfatik drenajın yokluğunun etkilerinin hala tam olarak değerlendirilmesi gerektiği belirtilmelidir. Bu protokol, izole edilen akciğer aparatının montajını, ardından deneysel laboratuvar hayvanlarından akciğerlerin ve kalbin cerrahi olarak çıkarılmasını ve kanülasyonunu tanımlamayı ve verilerin perfüzyon tekniğini ve sinyal işlemesini görüntülemeyi amaçlamaktadır. İzole akciğerin ortalama canlılığı 5-8 saat arasında değişmektedir; bu dönemde pulmoner kılcal geçirgenlik artarak ödem ve akciğer yaralanmasına neden oluyor. Korunmuş pulmoner dokunun işlevselliği, zaman içinde pulmoner ödemin boyutunu belirlemek için kullanılan kılcal filtrasyon katsayısı (Kfc) ile ölçülür.
Introduction
Brodie ve Dixon ilk olarak 1903 1’de ex-vivo akciğer perfüzyon sistemini tanımladılar. O zamandan beri, akciğerlerin fizyolojisi, farmakolojisi, toksikolojisi ve biyokimyasını incelemek için altın standart bir araç haline gelmiştir2,3. Teknik, akciğer nakillerinin uygulanabilirliğini değerlendirmek ve histamin, araşidonik asit metabolitleri ve P maddesi gibi enflamatuar mediatörlerin yanı sıra bronkokonstriksiyon, atelektaz ve pulmoner ödem gibi pulmoner fenomenler sırasında etkileşimlerinin etkisini belirlemek için tutarlı ve tekrarlanabilir bir yol sunar. İzole akciğer sistemi, biyojenik aminlerin genel dolaşımdan elimine edilmesinde akciğerlerin önemli rolünü ortaya çıkarmada önemli bir teknik olmuştur4,5. Ek olarak, sistem pulmoner yüzey aktif maddesinin biyokimyasını değerlendirmek için kullanılmıştır6. Son birkaç on yılda, ex-vivo akciğer perfüzyon sistemi akciğer nakli araştırmaları için ideal bir platform haline gelmiştir7. 2001 yılında Stig Steen liderliğindeki bir ekip, ex-vivo akciğer perfüzyon sisteminin ilk klinik uygulamasını, yaralanmaları nedeniyle başlangıçta transplantasyon merkezleri tarafından reddedilen 19 yaşındaki bir donörün akciğerlerini yenilemek için kullanarak tanımladı. Sol akciğer 65 dakika boyunca hasat edildi ve perfüzyon yapıldı; daha sonra, KOAH8’li 70 yaşındaki bir adama başarıyla nakledildi. Ex-vivo perfüzyonu kullanarak akciğer yenileme ile ilgili daha fazla araştırma, yaralı donör akciğerleri değerlendirmek ve tedavi etmek için genişletilmiş akciğer perfüzyonu için Toronto tekniğinin geliştirilmesine yol açtı9,10. Klinik olarak, ex-vivo akciğer perfüzyon sistemi, standart altı donör akciğerleri tedavi ederek ve yenileyerek donör havuzlarını artırmak için güvenli bir strateji olduğunu göstermiş ve standart kriterlere karşı risklerde veya sonuçlarda önemli bir fark sunmamıştır10.
İzole akciğer perfüzyon sisteminin en büyük avantajı, deneysel parametrelerin yapay bir laboratuvar kurulumu altında fizyolojik işlevini koruyan tam bir fonksiyonel organda değerlendirilebilmesidir. Ayrıca, pulmoner mekanik ventilasyonun ölçülmesi ve manipülasyonunun, pulmoner fizyolojinin hava yolu direnci, toplam vasküler direnç, gaz değişimi ve ödem oluşumu gibi bileşenlerini analiz etmesine izin verir, bu da bugüne kadar laboratuvar hayvanları üzerinde tam olarak in vivo olarak ölçülemez2. Özellikle, akciğerin perfüzyona maruz kalan çözeltinin bileşimi tamamen kontrol edilebilir, bu da maddelerin eklenmesinin etkilerini gerçek zamanlı olarak değerlendirmesini ve daha fazla çalışma için perfüzyondan örnek toplamasını sağlar11. İzole edilmiş akciğer sistemi ile çalışan araştırmacılar, mekanik ventilasyonun akciğer dokusunun çürümesine neden olduğunu ve kullanım süresini kısalttığını akılda bulundurmalıdır. Mekanik parametrelerdeki bu ilerleyici düşüş, deney sırasında akciğerlerin zaman zaman hiperenflasyona uğrayarak önemli ölçüde gecikebilir4. Yine de, hazırlık genellikle sekiz saatten fazla süremez. Ex-vivo akciğer perfüzyon sistemi için bir diğer husus merkezi sinir düzenlemesi ve lenfatik drenajın olmamasıdır. Yokluklarının etkileri henüz tam olarak anlaşılamamıştır ve bazı deneylerde potansiyel olarak önyargı kaynağı olabilir.
İzole akciğer perfüzyon sistemi tekniği tavşan modelinde yüksek derecede kıvam ve tekrarlanabilirlik ile yapılabilir. Bu çalışma, Mexico City’deki Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias’ta tavşan modeli için geliştirilen ex-vivo izole akciğer perfüzyon tekniğinin uygulanması için teknik ve cerrahi prosedürleri açıklar ve bu deneysel modelin uygulanmasındaki önemli adımlar hakkında içgörüleri paylaşmayı ve net bir kılavuz sağlamayı amaçlamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, pulmoner fizyoloji araştırmalarında önemli bir teknik olan izole akciğer perfüzyon sisteminin genel bir görünümünü görüntüler. İzole akciğer perfüzyon sistemi, kullanımlarında çok yönlülük sunar ve çok çeşitli hipotezlerin testinde ilgili çeşitli parametrelerin değerlendirilmesine izin verir15. İzole edilmiş bir akciğer sistemi, son on yılda organa özgü değerlendirmelerle ilgisini daha da ortaya koymuştur ve ayrıca mezenkimal kök <sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu makalenin yazılmasındaki desteği için Doktora Bettina Sommer Cervantes’e ve illüstrasyonlara verdiği destek için Kitzia Elena Lara Safont’a teşekkür eder.
Materials
| 2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1864 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4309 | |
| Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4138 | |
| Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder | sigma | 3912 | 500 g |
| Calcium chloride, CaCl2·2H2O. | JT Baker | 10035-04-8 | |
| Cryogenic vials | Corning | 430659 | 2 mL |
| D-glucosa, C6H12O6. | sigma | G5767 | |
| Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-3882 | |
| Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0064 | |
| Eppendorf tubes | |||
| Ethanol absolute HPLC grade | Caledon | ||
| Falcon tubes | 14 mL | ||
| Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 70-7001 | |
| Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9349 | |
| Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9703 | |
| Heparin | PISA | 5000 UI | |
| HPLC Column (C18 100A 5U) | Alltech | 98121213 | 150 mm x 4.6 mm |
| Hydrophilic Syringe Filter | Millex | SLLGR04NL | 4 mm |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0322 | |
| Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0125 | |
| Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4162 | |
| Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0020 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O | JT Baker | 10034-99-8 | |
| Microcentrifuge Tube | Corning | 430909 | |
| Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4298 | |
| New Zeland rabbits | |||
| PISABENTAL (Pentobarbital sodium) | PISA | Q-7833-215 | |
| PLUGSYS Case, Type 603* 7 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0045 | |
| PLUGSYS TCM Time Counter Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1750 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0065 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1793 | |
| PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1755 | |
| Potassium chloride, KCl. | JT Baker | 3040-01 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 7778-77-0 | |
| PROCIN (Xylacine clorhydrate) | PISA | Q-7833-099 | |
| Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4161 | |
| Scalpel knife | |||
| Serotonin 5-HT | |||
| Servo Controller for Perfusion (SCP | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-2806 | |
| Snap Cap Microcentrifuge Tube | Costar | 3620 | 1.7 mL |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| Sodium chloride, NaCl. | sigma | S9888 | |
| Surgical gloves No. 7 1/2 | |||
| Surgical gloves No. 8 | |||
| Taygon tubes | Masterflex | ||
| Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4163 |
References
- Dixon, W. E. Contributions to the physiology of the lungs: Part I. The bronchial muscles, their innervation, and the action of drugs upon them. The Journal of Physiology. 29 (2), 97-173 (1903).
- Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
- Roman, M. A., Nair, S., Tsui, S., Dunning, J., Parmar, J. S. Ex vivo lung perfusion: a comprehensive review of the development and exploration of future trends. Transplantation. 96 (6), 509-518 (2013).
- Delaunois, A., Gustin, P., Ansay, M. Multiple muscarinic receptor subtypes mediating pulmonary oedema in the rabbit. Pulmonary Pharmacology. 7 (3), 185-193 (1994).
- Delaunois, A., Gustin, P., Vargas, M., Ansay, M. Protective effect of various antagonists of inflammatory mediators against paraoxon-induced pulmonary edema in the rabbit. Toxicology and Applied Pharmacology. 132 (2), 343-345 (1995).
- Barr, H. A., Nicholas, T. E., Power, J. H. Control of alveolar surfactant in rats at rest and during prolonged hyperpnoea: pharmacological evidence for two tissue pools of surfactant. British Journal of Pharmacology. 93 (3), 473-482 (1988).
- Machuca, T. N., Cypel, M. Ex vivo lung perfusion. Journal of Thoracic Disease. 6 (8), 1054-1062 (2014).
- Steen, S., et al. First human transplantation of a nonacceptable donor lung after reconditioning ex vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (6), 2191-2194 (2007).
- Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 27 (12), 1319-1325 (2008).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. New England Journal of Medicine. 364 (15), 1431-1440 (2011).
- Kao, C. C., Parulekar, A. D. Is perfusate exchange during. Annals of Translational Medicine. 8 (3), 43 (2020).
- Alquicira-Mireles, J. . Participación de la serotonina en los cambios de permeabilidad vascular en la preservación pulmonar en conejo. , (2013).
- Arreola-Ramírez, J. L. . Papel de la liberación de acetilcolina y sustancia P en el deterioro de la función pulmonar en un modelo experimental de preservación pulmonar en conejo. , (2009).
- Isolated lung perfusion systems for small to large animal models. Harvard Apparatus. Hugo Sachs Elektronik (HSE) Available from: https://www.harvardapparatus.com/media/harvard/pdf/Isolated%20Lung%20Perfusion%20Systems%20Brochure.pdf (2021)
- Jiao, G. Evolving trend of EVLP: Advancements and emerging pathways. SN Comprehensive Clinical Medicine. 1 (4), 287-303 (2019).
- Mordant, P., et al. Mesenchymal stem cell treatment is associated with decreased perfusate concentration of interleukin-8 during ex vivo perfusion of donor lungs after 18-hour preservation. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1245-1254 (2016).
- Cowan, P. J., Hawthorne, W. J., Nottle, M. B. Xenogeneic transplantation and tolerance in the era of CRISPR-Cas9. Current Opinion in Organ Transplantation. 24 (1), 5-11 (2019).
- Collaborators, G. C. R. D. Prevalence and attributable health burden of chronic respiratory diseases, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet Respiratory Medicine. 8 (6), 585-596 (2020).
- Bravo-Reyna, C. C., Torres-Villalobos, G., Aguilar-Blas, N., Frías-Guillén, J., Guerra-Mora, J. R. Comparative study of capillary filtration coefficient (Kfc) determination by a manual and automatic perfusion system. Step by step technique review. Physiological Research. 68 (6), 901-908 (2019).
- Pereira, M. R., et al. COVID-19 in solid organ transplant recipients: Initial report from the US epicenter. American Journal of Transplantation. 20 (7), 1800-1808 (2020).
