생체 내 적용을 위한 나린제닌 용액의 제조
Summary
여기서, 상기 프로토콜은 생체내 복강 내 투여를 위한 나린제닌 용액의 제조를 제시한다. 나린제닌은 디메틸설폭사이드, 트윈 80 및 식염수의 혼합물에 완전히 용해된다. 나린제닌의 항당뇨병성 골다공증 효과는 혈당 검사, 주석산 내성 산 포스파타제 염색 및 효소 결합 면역 흡착 분석에 의해 평가되었습니다.
Abstract
화합물(파이토케미컬) 용액의 제조는 약물 스크리닝과 같은 연구에 적용되기 전에 간과되지만 중요한 단계입니다. 화합물의 완전한 가용화는 안전한 사용과 비교적 안정적인 결과를 위해 필요합니다. 여기서, 고지방 식이에서 나린제닌 용액을 제조하고 이의 복강내 투여를 위한 프로토콜과 스트렙토조토신(STZ) 유도 당뇨병 모델을 예로 들 수 있다. 소량의 나린제닌(3.52-6.69mg)을 사용하여 각각 에탄올, 디메틸설폭사이드(DMSO) 및 DMSO 플러스 생리 식염수(PS)로 재구성한 트윈 80을 포함한 용매에서 가용화를 테스트했습니다. 화합물의 완전한 가용화는 용액의 색상, 원심 분리 후 침전물의 존재 여부 (30 초 동안 2000 x g ) 또는 용액을 실온 (RT)에서 2 시간 동안 방치함으로써 결정된다. 안정한 화합물 / 식물 화학 용액을 얻은 후, 생체 내 연구에 필요한 화합물의 최종 농도 / 양은 용매 전용 (PS 없음) 스톡 용액에서 제조 한 다음 원하는대로 PS와 희석 / 혼합 할 수 있습니다. 마우스에서 나린제닌의 항당뇨병 골다공증 효과(20mg/kg BW, 2mg/mL에서 복강 내 투여)는 혈당, 골량(micro-CT) 및 골 흡수율(TRAP 염색 및 ELISA)을 측정하여 평가했습니다. 상세한 유기/식물화학 용액 준비를 원하는 연구원은 이 기술의 이점을 누릴 수 있습니다.
Introduction
약물 스크리닝을위한 식물 화학 화합물의 사용에 관한 연구가 증가함에 따라 최적의 효과를 평가하기 위해 식물 화학 용액을 준비하는 접근법에주의를 기울일 가치가 있습니다. 용해 방법, 투여량 및 농도와 같은 많은 측면이 화합물1을 제조할 때 고려되어야 한다.
용매 기반 용해는 유기 화합물 제조1에 널리 사용됩니다. 일반적으로 사용되는 용매에는 물, 오일, 디메틸 설폭 사이드 (DMSO), 메탄올, 에탄올, 포름산, 트윈, 글리세린 등이 포함됩니다2. 화합물이 위 위관영양에 의해 투여될 때 용해되지 않은 물질이 포함된 현탁액이 허용되지만, 완전히 용해된 용질은 정맥내 투여에 중요합니다. 오일 용액, 현탁액 및 에멀젼은 모세관 색전증을 유발할 수 있으므로, 특히 정맥 내, 근육 내 및 복강 내 주사를 투여 할 때 화합물 제조를위한 수용액이 제안됩니다3.
유효 용량 범위는 화합물마다 다르며 동일한 화합물로 치료되는 질병 사이에서도 다양합니다. 유효 및 안전한 용량과 농도의 결정은 문헌 및 예비 실험4에 의존한다. 여기서, 나린제닌 화합물의 제조가 예로서 입증된다.
폴리페놀 화합물인 나린제닌(4,5,7-트리하이드록시-플라바논)은 간 보호5, 항당뇨병6, 항염증제7 및 항산화 활성8에 대한 질병 치료에 연구되었습니다. 생체 내 적용의 경우, 나린제닌의 경구 투여가 일반적으로 사용됩니다. 이전 연구에서는 경구 위관 영양 9,10,11,12로 투여되는 50-100mg/kg의 0.5%-1% 카르복시메틸셀룰로오스, 0.5% 메틸셀룰로오스 용량, 0.01% DMSO 및 생리식염수(PS)에 나린제닌 용액을 준비하는 것을 보고했습니다. 게다가, 다른 연구에서는 3g/kg/d 3.6의 용량으로 경구 섭취를 위해13,14%(wt/wt)의 차우로 나린제닌을 보충했다고 보고했습니다. 연구에서는 에탄올 (0.5 % v / v), PS 및 DMSO를 사용하여 10-50 mg / kg15,16,17,18에서 복강 내 주사 용 나린 제닌을 용해시키는 것으로보고되었습니다. 측두엽 간질에 대한 연구에서, 마우스는 PS19에 용해 된 0.25 % 카르복시 메틸 셀룰로오스에 현탁 된 나린 제닌을 주사 받았다. 이러한 연구에서는 나린제닌 용액을 준비하기 위해 다른 용매를 사용했다고 보고하지만 용해 상태 및 동물 반응과 같은 자세한 내용은 보고되지 않았습니다.
이 프로토콜은 당뇨병 유발 골다공증에서 생체 내 적용을 위한 나린제닌 용액을 제조하는 절차를 소개합니다. 주사액의 제조는 용매 및 화합물의 제조, 투여량 추정, 용해 공정 및 여과를 포함한다. 투여량은 문헌 연구 및 예비 실험을 기반으로 3일 동안 매일 주사를 투여한 후 마우스를 모니터링하고 마우스 행동에 따라 투여량을 수정하여 결정하였다. 최종 선택된 농도 (20 mg / kg BW)는 고지방 식단과 스트렙토 조 토신 (STZ) 유발 당뇨병 마우스20,21에서 8 주 동안 주당 5 일 복강 내 투여되었습니다. 당뇨병성 골다공증에서 나린제닌의 효과는 혈당 검사, 마이크로 CT, 주석산 내성 산 포스파타제(TRAP) 염색 및 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)에 의해 평가되었습니다.
전반적으로, 40-400 mg / mL의 농도 범위에서 나린 제닌은 에탄올 또는 DMSO 또는 5 % (에탄올 또는 DMSO)와 95 % PS (v / v)에 완전히 용해되지 않는 것으로 관찰되었다. 그러나, 나린제닌은 3.52% DMSO, 3.52% 트윈 80, 및 92.96% PS의 혼합물에 완전히 용해되었다. 자세한 절차는 연구자가 생체 내 적용을 위한 주사 용액으로 화합물을 준비하는 데 도움이 될 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
식물 화학 용액의 제조는 생체 내에서의 적용을위한 기초입니다. 이 프로토콜에서, 나린제닌 용액의 제조는 에탄올, DMSO, Tween 80 및 0.9% PS와 같은 상이한 용매를 사용하여 입증되었다. 완전히 용해된 상태의 용액은 몇 시간 동안 실온에 유지되도록 하여 추가로 모니터링한 다음 생체 내에서 사용하기 전에 여과해야 합니다.
용매 측정은 이 프로토콜에서 중요한 단…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81973607 및 81573992)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 1.5 mL microtubes | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | Holding liquid |
| Automatic Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | Dehydrate samples |
| Blood glucose test strips | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
| Centrifuge | MIULAB | Minute centrifuge | Centrifugal solution |
| Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | Dehydration |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | Co-Solvent |
| ELISA assay kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c Mouse CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c |
|
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | Co-Solvent |
| Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | Decalcification |
| Filter | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | filter solution |
| Glacial acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP staining |
| Glucose meter | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | Serial number:COJJG8GW |
| Grinder | Shanghaijingxin Experimental Technology | Tissuelyser-24 | |
| Hematoxylin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D005 | TRAP staining |
| Insulin syringe | Shanghai Kantaray Medical Devices Co. | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | Intraperitoneal injection |
| L-(+) tartaric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP staining |
| Microscope | OLYMPUS | sz61 | Observation |
| Microtome | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | Section |
| Mini centrifuge | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | Centrifuge |
| Naphthol AS-BI phosphate | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP staining |
| Naringenin | Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd | 102764 | Solute |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | Embed samples |
| Pararosaniline base | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP staining |
| Pipettes | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | transferre Liquid |
| Plate reader | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 imaging reader | ELISA |
| Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | Neutral balsam | TRAP staining |
| saline (0.9 PS) | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | Solvent |
| Sodium acetate anhydrous | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP staining |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP staining |
| Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | Emulsifier |
| Zirconia beads | Shanghaijingxin Experimental Technology | 11079125z 454g | Grinding |
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