In Vivo Uygulama için Naringenin Solüsyonunun Hazırlanması
Summary
Burada protokol, in vivo intraperitoneal uygulama için naringenin solüsyonunun hazırlanmasını sunmaktadır. Naringenin, dimetilsülfoksit, Aradaki 80 ve salin karışımında tamamen çözülür. Naringeninin antidiyabetik osteoporotik etkileri kan şekeri testi, tartarat dirençli asit fosfataz boyama ve enzime bağlı immünosorbent testi ile değerlendirildi.
Abstract
Bir bileşik (fitokimyasal) çözeltinin hazırlanması, ilaç taraması gibi çalışmalarda uygulanmasından önce göz ardı edilen ancak kritik bir adımdır. Bileşiğin tamamen çözünmesi, güvenli kullanımı ve nispeten kararlı sonuçları için gereklidir. Burada, naringenin çözeltisinin hazırlanması için bir protokol ve yüksek yağlı bir diyette intraperitoneal uygulaması ve streptozotosin (STZ) ile indüklenen diyabetik model örnek olarak gösterilmiştir. Sırasıyla fizyolojik salinde (PS) yeniden oluşturulan etanol, dimetilsülfoksit (DMSO) ve DMSO artı Tween 80 dahil olmak üzere çözücülerde çözünmesini test etmek için az miktarda naringenin (3.52-6.69 mg) kullanıldı. Bileşiğin tam çözünmesi, çözeltinin rengini, santrifüjlemeden sonra çökeltilerin varlığını (30 s için 2000 x g) veya çözeltinin oda sıcaklığında (RT) 2 saat durmasına izin vererek belirlenir. Kararlı bir bileşik / fitokimyasal çözelti elde edildikten sonra, in vivo çalışmalar için gerekli olan bileşiğin nihai konsantrasyonu / miktarı, sadece çözücü (PS içermeyen) bir stok çözeltisinde hazırlanabilir ve daha sonra istenildiği gibi PS ile seyreltilebilir / karıştırılabilir. Naringeninin farelerde antidiyabetik osteoporotik etkileri (20 mg/kg b.w., 2 mg/mL’de intraperitoneal uygulama) kan şekeri, kemik kütlesi (mikro-BT) ve kemik rezorpsiyon hızı (TRAP boyama ve ELISA) ölçülerek değerlendirildi. Ayrıntılı organik / fitokimyasal çözelti preparatları arayan araştırmacılar bu teknikten yararlanacaktır.
Introduction
Fitokimyasal bileşiklerin ilaç taramasında kullanımı ile ilgili artan çalışmalarla, optimal etkilerini değerlendirmek için fitokimyasal çözeltiler hazırlama yaklaşımlarına dikkat edilmesi gerekmektedir. Çözünme metodolojisi, dozaj ve konsantrasyon gibi birçok husus, bileşik1’i hazırlarken dikkate alınmalıdır.
Solvent bazlı çözünme, organik bileşik hazırlama1 için yaygın olarak kullanılmaktadır. Yaygın olarak kullanılan çözücüler arasında su, yağ, dimetil sülfoksit (DMSO), metanol, etanol, formik asit, Ara, gliserin, vb.2 bulunur. Bileşik gastrik gavage tarafından uygulandığında çözünmemiş maddeler içeren bir süspansiyon kabul edilebilir olsa da, tamamen çözünmüş bir çözünmüş solut intravenöz uygulama için kritik öneme sahiptir. Yağ çözeltisi, süspansiyon ve emülsiyon kılcal embolilere neden olabileceğinden, özellikle intravenöz, intramüsküler ve intraperitoneal enjeksiyonlar uygulanırken bileşik hazırlama için sulu bir çözelti önerilmektedir3.
Etkili doz aralığı, bileşikler arasında ve hatta aynı bileşikle tedavi edilen hastalıklar arasında değişir. Etkili ve güvenli doz ve konsantrasyonun belirlenmesi literatüre ve ön deneylere bağlıdır4. Burada, bileşik naringeninin hazırlanması örnek olarak gösterilmiştir.
Polifenolik bir bileşik olan Naringenin (4,5,7-trihidroksi-flavanon), hepatoprotektif5, antidiyabetik6, anti-enflamatuar7 ve anti-oksidan aktiviteleri8 için hastalık tedavisinde incelenmiştir. İn vivo uygulamalar için, naringeninin oral uygulaması yaygın olarak kullanılır. Önceki çalışmalarda, oral gavage 9,10,11,12 ile uygulanan% 0.5-1 karboksimetil selüloz,% 0.5 metilselüloz dozu,% 0.0 DMSO ve% 0.5 metilselüloz dozunda,% 0.01 DMSO ve% 0.0 ila fizyolojik salin (PS) içinde naringenin çözeltisinin hazırlandığı bildirilmiştir. Ayrıca, diğer çalışmalar, 3.6 g / kg / d13,14’lük bir dozda oral alım için% 3’te (wt / wt) chow ile naringenin takviyesi yapıldığını bildirmiştir. Çalışmalar ayrıca 10-50 mg/ kg 15,16,17,18’de intraperitoneal enjeksiyon için naringenini çözmek için etanol (% 0.5 v / v), PS ve DMSO kullandığını bildirmiştir. Temporal lob epilepsisi ile ilgili bir çalışmada, farelere PS19’da çözünmüş% 0.25 karboksimetil selüloz içinde askıya alınmış bir naringenin enjeksiyonu verildi. Bu çalışmalar naringenin çözeltileri hazırlamak için farklı çözücülerin kullanıldığını bildirmesine rağmen, çözünme durumu ve hayvan tepkisi gibi daha fazla ayrıntı bildirilmemiştir.
Bu protokol, diyabetik kaynaklı osteoporozda in vivo uygulama için naringenin çözeltisi hazırlamak için bir prosedür sunar. Enjeksiyon çözeltisinin hazırlanması, çözücülerin ve bileşiklerin hazırlanmasını, dozaj tahminini, çözünme işlemini ve filtrasyonu içerir. Dozaj, literatür araştırmasına ve ön deneylere dayanarak, 3 gün boyunca her gün enjeksiyon uygulandıktan sonra farelerin izlenmesi ve dozajın fare davranışlarına göre değiştirilmesiyle belirlendi. Son seçilen konsantrasyon (20 mg / kg b.w.), yüksek yağlı bir diyet ve streptozotosin (STZ) ile indüklenen diyabetik fareler20,21’de 8 hafta boyunca haftada 5 gün intraperitoneal olarak uygulandı. Naringeninin diyabetik osteoporozdaki etkileri kan şekeri testi, mikro-BT, tartarat dirençli asit fosfataz (TRAP) boyama ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile değerlendirildi.
Genel olarak, 40-400 mg / mL konsantrasyon aralığında naringeninin etanol veya DMSO veya% 5 (etanol veya DMSO) artı% 95 PS (v / v) içinde tamamen çözünmediği gözlendi. Bununla birlikte, naringenin% 3.52 DMSO,% 3.52 Tween 80 ve% 92.96 PS karışımında tamamen çözüldü. Ayrıntılı prosedür, araştırmacıların bileşiği in vivo uygulama için bir enjeksiyon çözeltisi olarak hazırlamalarına yardımcı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fitokimyasal çözeltinin hazırlanması, in vivo uygulamasının temelidir. Bu protokolde, naringenin çözeltisinin hazırlanması, etanol, DMSO, Ara% 80 ve% 0.9 PS gibi farklı çözücüler kullanılarak gösterilmiştir. Tamamen çözünmüş durumdaki çözeltinin, uzun saatler boyunca oda sıcaklığında kalmasına izin verilerek daha fazla izlenmesi ve daha sonra in vivo kullanılmadan önce filtrelenmesi gerekir.
Solvent tayini bu protokolde kritik bir adımdır. Bi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81973607 ve 81573992) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1.5 mL microtubes | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | Holding liquid |
| Automatic Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | Dehydrate samples |
| Blood glucose test strips | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
| Centrifuge | MIULAB | Minute centrifuge | Centrifugal solution |
| Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | Dehydration |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | Co-Solvent |
| ELISA assay kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c Mouse CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c |
|
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | Co-Solvent |
| Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | Decalcification |
| Filter | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | filter solution |
| Glacial acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP staining |
| Glucose meter | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | Serial number:COJJG8GW |
| Grinder | Shanghaijingxin Experimental Technology | Tissuelyser-24 | |
| Hematoxylin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D005 | TRAP staining |
| Insulin syringe | Shanghai Kantaray Medical Devices Co. | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | Intraperitoneal injection |
| L-(+) tartaric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP staining |
| Microscope | OLYMPUS | sz61 | Observation |
| Microtome | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | Section |
| Mini centrifuge | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | Centrifuge |
| Naphthol AS-BI phosphate | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP staining |
| Naringenin | Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd | 102764 | Solute |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | Embed samples |
| Pararosaniline base | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP staining |
| Pipettes | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | transferre Liquid |
| Plate reader | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 imaging reader | ELISA |
| Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | Neutral balsam | TRAP staining |
| saline (0.9 PS) | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | Solvent |
| Sodium acetate anhydrous | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP staining |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP staining |
| Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | Emulsifier |
| Zirconia beads | Shanghaijingxin Experimental Technology | 11079125z 454g | Grinding |
References
- Stoye, D. Solvents. Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry. , (2000).
- Bouchard, D., et al. Optimization of the solvent-based dissolution method to sample volatile organic compound vapors for compound-specific isotope analysis. Journal of Chromatography A. 1520, 23-34 (2017).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (5), 600-613 (2011).
- Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33 (3), 378-455 (2012).
- Hernández-Aquino, E., Muriel, P. Beneficial effects of naringenin in liver diseases: Molecular mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 24 (16), 1679-1707 (2018).
- Den Hartogh, D. J., Tsiani, E. Antidiabetic properties of naringenin: A citrus fruit polyphenol. Biomolecules. 9 (3), (2019).
- Tutunchi, H., Naeini, F., Ostadrahimi, A., Hosseinzadeh-Attar, M. J. Naringenin, a flavanone with antiviral and anti-inflammatory effects: A promising treatment strategy against COVID-19. Phytotherapy Research. 34 (12), 3137-3147 (2020).
- Zaidun, N. H., Thent, Z. C., Latiff, A. A. Combating oxidative stress disorders with citrus flavonoid: Naringenin. Life Sciences. 208, 111-122 (2018).
- Tsuhako, R., Yoshida, H., Sugita, C., Kurokawa, M. Naringenin suppresses neutrophil infiltration into adipose tissue in high-fat diet-induced obese mice. Journal of Natural Medicines. 74 (1), 229-237 (2020).
- Annadurai, T., et al. Antihyperglycemic and anti-oxidant effects of a flavanone, naringenin, in streptozotocin-nicotinamide-induced experimental diabetic rats. Journal of Physiology and Biochemistry. 68 (3), 307-318 (2012).
- Li, S., et al. Naringenin improves insulin sensitivity in gestational diabetes mellitus mice through AMPK. Nutrition & Diabetes. 9 (1), 28 (2019).
- Devan, S., Janardhanam, V. A. Effect of Naringenin on metabolic markers, lipid profile and expression of GFAP in C6 glioma cells implanted rat’s brain. Annals of Neurosciences. 18 (4), 151-155 (2011).
- Burke, A. C., et al. Naringenin enhances the regression of atherosclerosis induced by a chow diet in Ldlr-/- mice. Atherosclerosis. 286, 60-70 (2019).
- Assini, J. M., et al. Naringenin prevents obesity, hepatic steatosis, and glucose intolerance in male mice independent of fibroblast growth factor 21. Endocrinology. 156 (6), 2087-2102 (2015).
- Alifarsangi, A., Esmaeili-Mahani, S., Sheibani, V., Abbasnejad, M. The citrus flavanone naringenin prevents the development of morphine analgesic tolerance and conditioned place preference in male rats. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 47 (1), 43-51 (2020).
- Sirovina, D., Oršolić, N., Gregorović, G., Končić, M. Z. Naringenin ameliorates pathological changes in liver and kidney of diabetic mice: a preliminary study. Archives of Occupational Hygiene and Toxicology. 67 (1), 19-24 (2016).
- Nguyen-Ngo, C., Willcox, J. C., Lappas, M. Anti-diabetic, anti-inflammatory, and anti-oxidant effects of Naringenin in an In vitro human model and an in vivo murine model of gestational diabetes mellitus. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (19), 1900224 (2019).
- Ahmed, L. A., Obaid, A. A. Z., Zaki, H. F., Agha, A. M. Naringenin adds to the protective effect of L-arginine in monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats: favorable modulation of oxidative stress, inflammation and nitric oxide. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 62, 161-170 (2014).
- Park, J., et al. Naringenin ameliorates kainic acid-induced morphological alterations in the dentate gyrus in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Neuroreport. 27 (15), 1182-1189 (2016).
- Matsui, H., et al. Early-stage Type 2 diabetes mellitus impairs erectile function and neurite outgrowth from the major pelvic ganglion and downregulates the gene expression of neurotrophic factors. Urology. 99, 1-7 (2017).
- Sharma, G., Ashhar, M. U., Aeri, V., Katare, D. P. Development and characterization of late-stage diabetes mellitus and -associated vascular complications. Life Sciences. 216, 295-304 (2019).
- Rowe, R. C., Sheskey, P. J., Owen, S. C. . Handbook of Pharmaceutical Excipients. , (2003).
- Fallahi, F., Roghani, M., Moghadami, S. Citrus flavonoid naringenin improves aortic reactivity in streptozotocin-diabetic rats. Indian Journal of Pharmacology. 44 (3), 382-386 (2012).
- Liu, F., Yang, H., Zhou, W. Comparison of the characteristics of induced and spontaneous db/db mouse models of type 2 diabetes mellitus. Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica. 22 (6), 54-59 (2014).
- Liu, S., Dong, J., Bian, Q. A dual regulatory effect of naringenin on bone homeostasis in two diabetic mice models. Traditional Medicine and Modern Medicine. 03 (02), 101-108 (2020).
- Sun, C., Wu, Z., Wang, Z., Zhang, H. Effect of ethanol/water solvents on phenolic profiles and anti-oxidant properties of beijing propolis extracts. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015, 595393 (2015).
- Huaman-Castilla, N. L., et al. The impact of temperature and ethanol concentration on the global recovery of specific polyphenols in an integrated HPLE/RP process on carménère pomace extracts. Molecules. 24 (17), (2019).
- van Thriel, C. Toxicology of solvents (including alcohol). Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
- Linakis, J. G., Cunningham, C. L. Effects of concentration of ethanol injected intraperitoneally on taste aversion, body temperature, and activity. Psychopharmacology. 64 (1), 61-65 (1979).
- Magwaza, L. S., et al. Rapid methods for extracting and quantifying phenolic compounds in citrus rinds. Food Science & Nutrition. 4 (1), 4-10 (2016).
- Smith, E. R., Hadidian, Z., Mason, M. M. The single–and repeated–dose toxicity of dimethyl sulfoxide. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 96-109 (1967).
- Colucci, M., et al. New insights of dimethyl sulphoxide effects (DMSO) on experimental in vivo models of nociception and inflammation. Pharmacological Research. 57 (6), 419-425 (2008).
- Kawakami, K., Oda, N., Miyoshi, K., Funaki, T., Ida, Y. Solubilization behavior of a poorly soluble drug under combined use of surfactants and co-solvents. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (1-2), 7-14 (2006).
