تحضير محلول نارينجينين للتطبيق في الجسم الحي
Summary
هنا ، يقدم البروتوكول تحضير محلول نارينجينين للإعطاء داخل الصفاق في الجسم الحي . يذوب نارينجينين بالكامل في خليط من ثنائي ميثيل سلفوكسيد وتوين 80 والمالحة. تم تقييم التأثيرات المضادة لهشاشة العظام للنارينجينين عن طريق اختبار الجلوكوز في الدم ، وتلطيخ الفوسفاتيز الحمضي المقاوم للطرطرات ، ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم.
Abstract
يعد تحضير محلول مركب (كيميائي نباتي) خطوة يتم التغاضي عنها ولكنها حاسمة قبل تطبيقه في دراسات مثل فحص الأدوية. الذوبان الكامل للمركب ضروري للاستخدام الآمن والنتائج المستقرة نسبيا. هنا ، يتم عرض بروتوكول لإعداد محلول نارينجينين وإدارته داخل الصفاق في نظام غذائي عالي الدهون ونموذج السكري الناجم عن الستربتوزوتوسين (STZ) كمثال. تم استخدام كمية صغيرة من نارينجينين (3.52-6.69 مجم) لاختبار ذوبانه في المذيبات ، بما في ذلك الإيثانول وثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) و DMSO بالإضافة إلى Tween 80 المعاد تشكيله في محلول ملحي فسيولوجي (PS) ، على التوالي. يتم تحديد الذوبان الكامل للمركب من خلال مراقبة لون المحلول ، أو وجود رواسب بعد الطرد المركزي (2000 × جم لمدة 30 ثانية) ، أو السماح للمحلول بالوقوف لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT). بعد الحصول على مركب مستقر / محلول كيميائي نباتي ، يمكن تحضير التركيز / الكمية النهائية للمركب المطلوب للدراسات في الجسم الحي في محلول مخزون مذيب فقط (بدون PS) ، ثم تخفيفه / خلطه مع PS حسب الرغبة. تم تقييم التأثيرات المضادة لهشاشة العظام للنارينجينين في الفئران (الإعطاء داخل الصفاق عند 20 مغ/كغ من وزن الجسم، 2 مغ/مل) عن طريق قياس نسبة الجلوكوز في الدم، وكتلة العظام (التصوير المقطعي المحوسب الدقيق)، ومعدل ارتشاف العظام (تلطيخ TRAP وELISA). سيستفيد الباحثون الذين يبحثون عن مستحضرات مفصلة للمحلول العضوي / الكيميائي النباتي من هذه التقنية.
Introduction
مع زيادة الدراسات المتعلقة باستخدام المركبات الكيميائية النباتية لفحص الأدوية ، فإن مناهج إعداد المحاليل الكيميائية النباتية لتقييم آثارها المثلى تستحق الاهتمام بها. يجب مراعاة العديد من الجوانب مثل منهجية الذوبان والجرعة والتركيز عند تحضير المركب1.
يستخدم الذوبان القائم على المذيبات على نطاق واسع لإعداد المركب العضوي1. تشمل المذيبات شائعة الاستخدام الماء والزيت وثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) والميثانول والإيثانول وحمض الفورميك والمراهقين والجلسرين وما إلى ذلك2. على الرغم من أن التعليق بمواد غير مذابة يكون مقبولا عندما يتم إعطاء المركب عن طريق التجويف المعدي ، إلا أن المذاب المذاب بالكامل أمر بالغ الأهمية للإعطاء عن طريق الوريد. نظرا لأن محلول الزيت والتعليق والمستحلب يمكن أن يسبب انسدادات شعرية ، يقترح وجود محلول مائي لإعداد المركب ، خاصة عند إعطاء الحقن في الوريد والعضل وداخل الصفاق3.
يختلف نطاق الجرعة الفعالة بين المركبات وحتى بين الأمراض التي تعالج بنفس المركب. تعتمد تحديد الجرعة الفعالة والآمنة والتركيز على الأدبيات والتجارب الأولية4. هنا ، يتم توضيح إعداد مركب naringenin كمثال.
تمت دراسة Naringenin (4،5،7-trihydroxy-flavanone) ، وهو مركب بوليفينول ، في علاج الأمراض ل hepatoprotective5 ، ومضاد لمرض السكر6 ، ومضاد للالتهابات7 ، وأنشطة مضادة للأكسدة8. بالنسبة للتطبيقات في الجسم الحي ، يشيع استخدام تناول نارينجينين عن طريق الفم. أفادت الدراسات السابقة عن تحضير محلول نارينجينين في 0.5٪ -1٪ كربوكسي ميثيل السليلوز ، وجرعة 0.5٪ ميثيل سلولوز ، و 0.01٪ DMSO ، ومحلول ملحي فسيولوجي (PS) عند 50-100 مجم / كجم ، يتم إعطاؤه عن طريق التجويف الفموي9،10،11،12. إلى جانب ذلك ، أبلغت دراسات أخرى عن مكملات نارينجينين مع تشاو بنسبة 3٪ (بالوزن / الوزن) للتناول الفموي بجرعة 3.6 جم / كجم / يوم13,14. وقد أبلغت الدراسات أيضا عن استخدام الإيثانول (0.5٪ v / v) و PS و DMSO لإذابة نارينجينين للحقن داخل الصفاق عند 10-50 مجم / كجم15،16،17،18. في دراسة لصرع الفص الصدغي ، تلقت الفئران حقنة نارينجينين معلقة في 0.25٪ كربوكسي ميثيل السليلوز المذاب في PS19. على الرغم من أن هذه الدراسات تشير إلى استخدام مذيبات مختلفة لإعداد محاليل نارينجينين ، إلا أنه لم يتم الإبلاغ عن مزيد من التفاصيل ، مثل حالة الذوبان واستجابة الحيوان.
يقدم هذا البروتوكول إجراء لإعداد محلول نارينجينين للتطبيق في الجسم الحي في هشاشة العظام الناجمة عن مرض السكري. يتضمن تحضير محلول الحقن تحضير المذيبات والمركبات وتقدير الجرعة وعملية الذوبان والترشيح. تم تحديد الجرعة بناء على أبحاث الأدبيات والتجارب الأولية من خلال مراقبة الفئران بعد إعطاء الحقن كل يوم لمدة 3 أيام وتعديل الجرعة وفقا لسلوكيات الفئران. تم إعطاء التركيز النهائي المختار (20 مغ / كغ من وزن الجسم) داخل الصفاق 5 أيام في الأسبوع لمدة 8 أسابيع في نظام غذائي غني بالدهون والفئران السكرية التي يسببها الستربتوزوتوسين (STZ)20,21. تم تقييم آثار نارينجينين في هشاشة العظام السكري عن طريق اختبار الجلوكوز في الدم ، والتصوير المقطعي المحوسب الدقيق ، وتلطيخ حمض الفوسفاتيز المقاوم للطرطرات (TRAP) ، ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).
بشكل عام ، لوحظ أن نارينجينين في نطاق تركيز 40-400 ملغم / مل لم يذوب تماما في الإيثانول أو DMSO أو 5٪ (الإيثانول أو DMSO) بالإضافة إلى 95٪ PS (v / v). ومع ذلك ، يذوب نارينجينين تماما في خليط من 3.52٪ DMSO و 3.52٪ توين 80 و 92.96٪ PS. سيساعد الإجراء التفصيلي الباحثين على تحضير المركب كمحلول حقن للتطبيق في الجسم الحي .
Protocol
Representative Results
Discussion
إعداد محلول كيميائي نباتي هو الأساس لتطبيقه في الجسم الحي. في هذا البروتوكول ، تم توضيح تحضير محلول نارينجينين باستخدام مذيبات مختلفة ، مثل الإيثانول ، DMSO ، Tween 80 ، و 0.9٪ PS. يحتاج المحلول في حالة الذوبان تماما إلى مزيد من المراقبة من خلال السماح له بالبقاء في درجة حرارة الغرفة لبضع ساعا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81973607 و 81573992).
Materials
| 1.5 mL microtubes | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | Holding liquid |
| Automatic Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | Dehydrate samples |
| Blood glucose test strips | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
| Centrifuge | MIULAB | Minute centrifuge | Centrifugal solution |
| Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | Dehydration |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | Co-Solvent |
| ELISA assay kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c Mouse CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c |
|
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | Co-Solvent |
| Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | Decalcification |
| Filter | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | filter solution |
| Glacial acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP staining |
| Glucose meter | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | Serial number:COJJG8GW |
| Grinder | Shanghaijingxin Experimental Technology | Tissuelyser-24 | |
| Hematoxylin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D005 | TRAP staining |
| Insulin syringe | Shanghai Kantaray Medical Devices Co. | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | Intraperitoneal injection |
| L-(+) tartaric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP staining |
| Microscope | OLYMPUS | sz61 | Observation |
| Microtome | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | Section |
| Mini centrifuge | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | Centrifuge |
| Naphthol AS-BI phosphate | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP staining |
| Naringenin | Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd | 102764 | Solute |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | Embed samples |
| Pararosaniline base | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP staining |
| Pipettes | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | transferre Liquid |
| Plate reader | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 imaging reader | ELISA |
| Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | Neutral balsam | TRAP staining |
| saline (0.9 PS) | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | Solvent |
| Sodium acetate anhydrous | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP staining |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP staining |
| Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | Emulsifier |
| Zirconia beads | Shanghaijingxin Experimental Technology | 11079125z 454g | Grinding |
References
- Stoye, D. Solvents. Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry. , (2000).
- Bouchard, D., et al. Optimization of the solvent-based dissolution method to sample volatile organic compound vapors for compound-specific isotope analysis. Journal of Chromatography A. 1520, 23-34 (2017).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (5), 600-613 (2011).
- Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33 (3), 378-455 (2012).
- Hernández-Aquino, E., Muriel, P. Beneficial effects of naringenin in liver diseases: Molecular mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 24 (16), 1679-1707 (2018).
- Den Hartogh, D. J., Tsiani, E. Antidiabetic properties of naringenin: A citrus fruit polyphenol. Biomolecules. 9 (3), (2019).
- Tutunchi, H., Naeini, F., Ostadrahimi, A., Hosseinzadeh-Attar, M. J. Naringenin, a flavanone with antiviral and anti-inflammatory effects: A promising treatment strategy against COVID-19. Phytotherapy Research. 34 (12), 3137-3147 (2020).
- Zaidun, N. H., Thent, Z. C., Latiff, A. A. Combating oxidative stress disorders with citrus flavonoid: Naringenin. Life Sciences. 208, 111-122 (2018).
- Tsuhako, R., Yoshida, H., Sugita, C., Kurokawa, M. Naringenin suppresses neutrophil infiltration into adipose tissue in high-fat diet-induced obese mice. Journal of Natural Medicines. 74 (1), 229-237 (2020).
- Annadurai, T., et al. Antihyperglycemic and anti-oxidant effects of a flavanone, naringenin, in streptozotocin-nicotinamide-induced experimental diabetic rats. Journal of Physiology and Biochemistry. 68 (3), 307-318 (2012).
- Li, S., et al. Naringenin improves insulin sensitivity in gestational diabetes mellitus mice through AMPK. Nutrition & Diabetes. 9 (1), 28 (2019).
- Devan, S., Janardhanam, V. A. Effect of Naringenin on metabolic markers, lipid profile and expression of GFAP in C6 glioma cells implanted rat’s brain. Annals of Neurosciences. 18 (4), 151-155 (2011).
- Burke, A. C., et al. Naringenin enhances the regression of atherosclerosis induced by a chow diet in Ldlr-/- mice. Atherosclerosis. 286, 60-70 (2019).
- Assini, J. M., et al. Naringenin prevents obesity, hepatic steatosis, and glucose intolerance in male mice independent of fibroblast growth factor 21. Endocrinology. 156 (6), 2087-2102 (2015).
- Alifarsangi, A., Esmaeili-Mahani, S., Sheibani, V., Abbasnejad, M. The citrus flavanone naringenin prevents the development of morphine analgesic tolerance and conditioned place preference in male rats. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 47 (1), 43-51 (2020).
- Sirovina, D., Oršolić, N., Gregorović, G., Končić, M. Z. Naringenin ameliorates pathological changes in liver and kidney of diabetic mice: a preliminary study. Archives of Occupational Hygiene and Toxicology. 67 (1), 19-24 (2016).
- Nguyen-Ngo, C., Willcox, J. C., Lappas, M. Anti-diabetic, anti-inflammatory, and anti-oxidant effects of Naringenin in an In vitro human model and an in vivo murine model of gestational diabetes mellitus. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (19), 1900224 (2019).
- Ahmed, L. A., Obaid, A. A. Z., Zaki, H. F., Agha, A. M. Naringenin adds to the protective effect of L-arginine in monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats: favorable modulation of oxidative stress, inflammation and nitric oxide. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 62, 161-170 (2014).
- Park, J., et al. Naringenin ameliorates kainic acid-induced morphological alterations in the dentate gyrus in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Neuroreport. 27 (15), 1182-1189 (2016).
- Matsui, H., et al. Early-stage Type 2 diabetes mellitus impairs erectile function and neurite outgrowth from the major pelvic ganglion and downregulates the gene expression of neurotrophic factors. Urology. 99, 1-7 (2017).
- Sharma, G., Ashhar, M. U., Aeri, V., Katare, D. P. Development and characterization of late-stage diabetes mellitus and -associated vascular complications. Life Sciences. 216, 295-304 (2019).
- Rowe, R. C., Sheskey, P. J., Owen, S. C. . Handbook of Pharmaceutical Excipients. , (2003).
- Fallahi, F., Roghani, M., Moghadami, S. Citrus flavonoid naringenin improves aortic reactivity in streptozotocin-diabetic rats. Indian Journal of Pharmacology. 44 (3), 382-386 (2012).
- Liu, F., Yang, H., Zhou, W. Comparison of the characteristics of induced and spontaneous db/db mouse models of type 2 diabetes mellitus. Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica. 22 (6), 54-59 (2014).
- Liu, S., Dong, J., Bian, Q. A dual regulatory effect of naringenin on bone homeostasis in two diabetic mice models. Traditional Medicine and Modern Medicine. 03 (02), 101-108 (2020).
- Sun, C., Wu, Z., Wang, Z., Zhang, H. Effect of ethanol/water solvents on phenolic profiles and anti-oxidant properties of beijing propolis extracts. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015, 595393 (2015).
- Huaman-Castilla, N. L., et al. The impact of temperature and ethanol concentration on the global recovery of specific polyphenols in an integrated HPLE/RP process on carménère pomace extracts. Molecules. 24 (17), (2019).
- van Thriel, C. Toxicology of solvents (including alcohol). Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
- Linakis, J. G., Cunningham, C. L. Effects of concentration of ethanol injected intraperitoneally on taste aversion, body temperature, and activity. Psychopharmacology. 64 (1), 61-65 (1979).
- Magwaza, L. S., et al. Rapid methods for extracting and quantifying phenolic compounds in citrus rinds. Food Science & Nutrition. 4 (1), 4-10 (2016).
- Smith, E. R., Hadidian, Z., Mason, M. M. The single–and repeated–dose toxicity of dimethyl sulfoxide. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 96-109 (1967).
- Colucci, M., et al. New insights of dimethyl sulphoxide effects (DMSO) on experimental in vivo models of nociception and inflammation. Pharmacological Research. 57 (6), 419-425 (2008).
- Kawakami, K., Oda, N., Miyoshi, K., Funaki, T., Ida, Y. Solubilization behavior of a poorly soluble drug under combined use of surfactants and co-solvents. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (1-2), 7-14 (2006).
