Préparation de la solution de naringénine pour application in vivo
Summary
Ici, le protocole présente la préparation de la solution de naringénine pour l’administration intrapéritonéale in vivo . La naringénine est complètement dissoute dans un mélange de diméthylsulfoxyde, de Tween 80 et de solution saline. Les effets ostéoporotiques antidiabétiques de la naringénine ont été évalués par des tests de glycémie, une coloration de la phosphatase acide résistante au tartrate et un dosage immuno-enzymatique.
Abstract
La préparation d’une solution composée (phytochimique) est une étape négligée mais critique avant son application dans des études telles que le dépistage de médicaments. La solubilisation complète du composé est nécessaire pour son utilisation sûre et des résultats relativement stables. Ici, un protocole pour la préparation de la solution de naringénine et son administration intrapéritonéale dans un régime riche en graisses et un modèle diabétique induit par la streptozotocine (STZ) est démontré à titre d’exemple. Une petite quantité de naringénine (3,52-6,69 mg) a été utilisée pour tester sa solubilisation dans des solvants, y compris l’éthanol, le diméthylsulfoxyde (DMSO) et le DMSO plus Tween 80 reconstitué dans une solution saline physiologique (PS), respectivement. La solubilisation complète du composé est déterminée en observant la couleur de la solution, la présence de précipités après centrifugation (2000 x g pendant 30 s), ou en laissant la solution reposer pendant 2 h à température ambiante (RT). Après avoir obtenu une solution composée/phytochimique stable, la concentration/quantité finale du composé requise pour les études in vivo peut être préparée dans une solution mère contenant uniquement du solvant (sans PS), puis diluée/mélangée avec du PS selon les besoins. Les effets ostéoporotiques antidiabétiques de la naringénine chez la souris (administration intrapéritonéale à 20 mg/kg de poids corporel, 2 mg/mL) ont été évalués en mesurant la glycémie, la masse osseuse (micro-TDM) et le taux de résorption osseuse (coloration TRAP et ELISA). Les chercheurs à la recherche de préparations détaillées de solutions organiques/phytochimiques bénéficieront de cette technique.
Introduction
Avec l’augmentation des études concernant l’utilisation de composés phytochimiques pour le dépistage de médicaments, les approches visant à préparer des solutions phytochimiques pour évaluer leurs effets optimaux méritent une attention particulière. De nombreux aspects tels que la méthodologie de dissolution, la posologie et la concentration doivent être pris en compte lors de la préparation du composé1.
La dissolution à base de solvant est largement utilisée pour la préparation de composés organiques1. Les solvants couramment utilisés comprennent l’eau, l’huile, le diméthylsulfoxyde (DMSO), le méthanol, l’éthanol, l’acide formique, le Tween, la glycérine, etc.2. Bien qu’une suspension avec des substances non dissoutes soit acceptable lorsque le composé est administré par gavage gastrique, un soluté entièrement dissous est essentiel pour l’administration intraveineuse. Étant donné que la solution d’huile, la suspension et l’émulsion peuvent provoquer des embolies capillaires, une solution aqueuse pour la préparation de composés est suggérée, en particulier lors de l’administration d’injections intraveineuses, intramusculaires et intrapéritonéales3.
La gamme de doses efficaces varie selon les composés et même entre les maladies traitées avec le même composé. La détermination de la dose efficace et sûre et de la concentration dépend de la littérature et des expériences préliminaires4. Ici, la préparation du composé naringénine est démontrée à titre d’exemple.
La naringénine (4,5,7-trihydroxy-flavanone), un composé polyphénolique, a été étudiée dans le traitement de la maladie pour ses activités hépatoprotectrices5, antidiabétiques6, anti-inflammatoires7 et anti-oxydantes8. Pour les applications in vivo, l’administration orale de naringénine est couramment utilisée. Des études antérieures ont rapporté la préparation d’une solution de naringénine dans 0,5% -1% de carboxyméthylcellulose, une dose de méthylcellulose à 0,5%, 0,01% de DMSO et une solution saline physiologique (PS) à 50-100 mg / kg, administrée par gavage oral 9,10,11,12. En outre, d’autres études ont rapporté une supplémentation en naringénine avec du chow à 3% (poids / poids) pour une prise orale à une dose de 3,6 g / kg / j13,14. Des études ont également rapporté l’utilisation d’éthanol (0,5% v/v), de PS et de DMSO pour dissoudre la naringénine pour injection intrapéritonéale à raison de 10-50 mg / kg15,16,17,18. Dans une étude de l’épilepsie du lobe temporal, des souris ont reçu une injection de naringénine en suspension dans 0,25% de carboxyméthylcellulose dissoute dans PS19. Bien que ces études rapportent l’utilisation de différents solvants pour préparer des solutions de naringénine, d’autres détails, tels que le statut de dissolution et la réponse animale, n’ont pas été rapportés.
Ce protocole introduit une procédure de préparation de la solution de naringénine pour application in vivo dans l’ostéoporose induite par le diabète. La préparation de la solution injectable comprend la préparation des solvants et des composés, l’estimation du dosage, le processus de dissolution et la filtration. La posologie a été déterminée sur la base de recherches documentaires et d’expériences préliminaires en surveillant les souris après avoir administré des injections tous les jours pendant 3 jours et en modifiant la posologie en fonction des comportements des souris. La concentration finale choisie (20 mg/kg de poids corporel) a été administrée par voie intrapéritonéale 5 jours par semaine pendant 8 semaines chez des souris diabétiques riches en graisses et induites par la streptozotocine (STZ)20,21. Les effets de la naringénine dans l’ostéoporose diabétique ont été évalués par des tests de glycémie, une micro-TDM, une coloration à la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP) et un test immuno-enzymatique (ELISA).
Dans l’ensemble, il a été observé que la naringénine à une plage de concentration de 40 à 400 mg/mL ne se dissolvait pas complètement dans l’éthanol ou le DMSO ou 5 % (éthanol ou DMSO) plus 95 % de PS (v/v). Cependant, la naringénine s’est complètement dissoute dans un mélange de 3,52% de DMSO, 3,52% de Tween 80 et 92,96% de PS. La procédure détaillée aidera les chercheurs à préparer le composé en tant que solution d’injection pour une application in vivo .
Protocol
Representative Results
Discussion
La préparation de la solution phytochimique est la base de son application in vivo. Dans ce protocole, la préparation de la solution de naringénine a été démontrée en utilisant différents solvants, tels que l’éthanol, le DMSO, le Tween 80 et le 0,9% PS. La solution à l’état complètement dissous doit être surveillée davantage en la laissant rester à température ambiante pendant quelques heures prolongées, puis filtrée avant d’être utilisée in vivo.
La…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81973607 et 81573992).
Materials
| 1.5 mL microtubes | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | Holding liquid |
| Automatic Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | Dehydrate samples |
| Blood glucose test strips | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
| Centrifuge | MIULAB | Minute centrifuge | Centrifugal solution |
| Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | Dehydration |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | Co-Solvent |
| ELISA assay kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c Mouse CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c |
|
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | Co-Solvent |
| Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | Decalcification |
| Filter | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | filter solution |
| Glacial acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP staining |
| Glucose meter | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | Serial number:COJJG8GW |
| Grinder | Shanghaijingxin Experimental Technology | Tissuelyser-24 | |
| Hematoxylin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D005 | TRAP staining |
| Insulin syringe | Shanghai Kantaray Medical Devices Co. | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | Intraperitoneal injection |
| L-(+) tartaric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP staining |
| Microscope | OLYMPUS | sz61 | Observation |
| Microtome | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | Section |
| Mini centrifuge | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | Centrifuge |
| Naphthol AS-BI phosphate | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP staining |
| Naringenin | Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd | 102764 | Solute |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | Embed samples |
| Pararosaniline base | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP staining |
| Pipettes | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | transferre Liquid |
| Plate reader | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 imaging reader | ELISA |
| Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | Neutral balsam | TRAP staining |
| saline (0.9 PS) | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | Solvent |
| Sodium acetate anhydrous | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP staining |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP staining |
| Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | Emulsifier |
| Zirconia beads | Shanghaijingxin Experimental Technology | 11079125z 454g | Grinding |
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