Herstellung von Naringenin-Lösung für die In-vivo-Anwendung
Summary
Hier stellt das Protokoll die Herstellung von Naringeninlösung für die intraperitoneale In-vivo-Verabreichung vor. Naringenin ist vollständig in einer Mischung aus Dimethylsulfoxid, Tween 80 und Kochsalzlösung gelöst. Die antidiabetischen osteoporotischen Wirkungen von Naringenin wurden durch Blutzuckertests, Tartrat-resistente saure Phosphatase-Färbung und enzymgebundenen Immunassay beurteilt.
Abstract
Die Herstellung einer zusammengesetzten (phytochemischen) Lösung ist ein übersehener, aber kritischer Schritt vor ihrer Anwendung in Studien wie dem Arzneimittelscreening. Die vollständige Solubilisierung der Verbindung ist für ihre sichere Verwendung und relativ stabile Ergebnisse notwendig. Hier wird ein Protokoll zur Herstellung von Naringeninlösung und deren intraperitonealer Verabreichung in einem fettreichen Diät- und Streptozotocin (STZ)-induzierten diabetischen Modell als Beispiel demonstriert. Eine kleine Menge Naringenin (3,52-6,69 mg) wurde verwendet, um seine Solubilisierung in Lösungsmitteln zu testen, einschließlich Ethanol, Dimethylsulfoxid (DMSO) und DMSO plus Tween 80, rekonstituiert in physiologischer Kochsalzlösung (PS). Die vollständige Solubilisierung der Verbindung wird durch Beobachtung der Farbe der Lösung, des Vorhandenseins von Ausfällen nach dem Zentrifugieren (2000 x g für 30 s) oder durch Stehen der Lösung für 2 h bei Raumtemperatur (RT) bestimmt. Nach Erhalt einer stabilen Verbindung/phytochemischen Lösung kann die endgültige Konzentration/Menge der für In-vivo-Studien erforderlichen Verbindung in einer reinen Lösungsmittel-Stammlösung (kein PS) hergestellt und dann wie gewünscht mit PS verdünnt/gemischt werden. Die antidiabetische osteoporotische Wirkung von Naringenin bei Mäusen (intraperitoneale Verabreichung bei 20 mg/kg Körpergewicht, 2 mg/ml) wurde durch Messung von Blutzucker, Knochenmasse (Mikro-CT) und Knochenresorptionsrate (TRAP-Färbung und ELISA) beurteilt. Forscher, die nach detaillierten organischen / phytochemischen Lösungspräparaten suchen, werden von dieser Technik profitieren.
Introduction
Mit zunehmenden Studien über die Verwendung von phytochemischen Verbindungen für das Arzneimittelscreening sind Ansätze zur Herstellung phytochemischer Lösungen zur Bewertung ihrer optimalen Wirkungen beachtenswert. Viele Aspekte wie die Auflösungsmethodik, Dosierung und Konzentration sind bei der Herstellung der Verbindung1 zu berücksichtigen.
Lösungsmittelbasierte Auflösung wird häufig für die Herstellung organischer Verbindungen verwendet1. Zu den üblicherweise verwendeten Lösungsmitteln gehören Wasser, Öl, Dimethylsulfoxid (DMSO), Methanol, Ethanol, Ameisensäure, Tween, Glycerin usw.2. Obwohl eine Suspension mit ungelösten Substanzen akzeptabel ist, wenn die Verbindung durch Magengavage verabreicht wird, ist ein vollständig gelöster gelöster gelöster Stoff für die intravenöse Verabreichung kritisch. Da Öllösung, Suspension und Emulsion Kapillarembolien verursachen können, wird eine wässrige Lösung zur Herstellung von Verbindungen empfohlen, insbesondere bei der Verabreichung intravenöser, intramuskulärer und intraperitonealer Injektionen3.
Der effektive Dosisbereich variiert zwischen Verbindungen und sogar zwischen Krankheiten, die mit derselben Verbindung behandelt werden. Die Bestimmung der effektiven und der sicheren Dosis sowie der Konzentration hängt von der Literatur und den Vorversuchen ab4. Hier wird beispielhaft die Herstellung der Verbindung Naringenin demonstriert.
Naringenin (4,5,7-Trihydroxyflavanon), eine polyphenolische Verbindung, wurde in der Krankheitsbehandlung auf seine hepatoprotektive5, antidiabetische6, entzündungshemmende7 und antioxidative Wirkung8 untersucht. Für In-vivo-Anwendungen wird üblicherweise die orale Verabreichung von Naringenin verwendet. Frühere Studien berichteten über die Herstellung von Naringeninlösung in 0,5%-1% Carboxymethylcellulose, 0,5% Methylcellulosedosis, 0,01% DMSO und physiologischer Kochsalzlösung (PS) bei 50-100 mg/kg, verabreicht durch orale Sonde 9,10,11,12. Darüber hinaus haben andere Studien berichtet, dass Naringenin mit Chow zu 3% (Gew./Gew.) zur oralen Einnahme in einer Dosis von 3,6 g/kg/d13,14 ergänzt wurde. Studien haben auch berichtet, dass Ethanol (0,5% v / v), PS und DMSO verwendet wurden, um Naringenin für die intraperitoneale Injektion bei 10-50 mg / kg 15,16,17,18 aufzulösen. In einer Studie zur Temporallappenepilepsie erhielten Mäuse eine Injektion von Naringenin, suspendiert in 0,25% Carboxymethylcellulose, gelöst in PS19. Obwohl diese Studien über die Verwendung verschiedener Lösungsmittel zur Herstellung von Naringeninlösungen berichten, wurden keine weiteren Details wie Auflösungsstatus und Tierreaktion berichtet.
Dieses Protokoll führt ein Verfahren zur Herstellung von Naringeninlösung für die In-vivo-Anwendung bei diabetischer Osteoporose ein. Die Herstellung der Injektionslösung umfasst die Herstellung von Lösungsmitteln und Verbindungen, die Dosierungsschätzung, den Lösungsprozess und die Filtration. Die Dosierung wurde auf der Grundlage von Literaturrecherchen und vorläufigen Experimenten bestimmt, indem Mäuse nach der täglichen Verabreichung von Injektionen für 3 Tage überwacht und die Dosierung entsprechend dem Verhalten der Maus geändert wurde. Die endgültige gewählte Konzentration (20 mg/kg Körpergewicht) wurde intraperitoneal 5 Tage pro Woche für 8 Wochen in einer fettreichen Diät verabreicht und Streptozotocin (STZ)-induzierte diabetische Mäuse20,21. Die Wirkungen von Naringenin bei diabetischer Osteoporose wurden durch Blutzuckertests, Mikro-CT, Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) -Färbung und Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) bewertet.
Insgesamt wurde beobachtet, dass sich Naringenin in einem Konzentrationsbereich von 40-400 mg/ml weder in Ethanol noch DMSO oder 5% (Ethanol oder DMSO) plus 95% PS (v/v) vollständig löste. Naringenin löste sich jedoch vollständig in einer Mischung aus 3,52% DMSO, 3,52% Tween 80 und 92,96% PS. Das detaillierte Verfahren wird den Forschern helfen, die Verbindung als Injektionslösung für die In-vivo-Anwendung vorzubereiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Herstellung der phytochemischen Lösung ist die Grundlage für ihre Anwendung in vivo. In diesem Protokoll wurde die Herstellung von Naringeninlösung unter Verwendung verschiedener Lösungsmittel wie Ethanol, DMSO, Tween 80 und 0,9% PS demonstriert. Die Lösung im vollständig gelösten Zustand muss weiter überwacht werden, indem sie für einige längere Stunden bei Raumtemperatur bleibt und dann gefiltert wird, bevor sie in vivo verwendet wird.
Die Lösungsmittelbestim…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81973607 und 81573992) unterstützt.
Materials
| 1.5 mL microtubes | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | Holding liquid |
| Automatic Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | Dehydrate samples |
| Blood glucose test strips | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
| Centrifuge | MIULAB | Minute centrifuge | Centrifugal solution |
| Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | Dehydration |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | Co-Solvent |
| ELISA assay kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c Mouse CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c |
|
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | Co-Solvent |
| Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | Decalcification |
| Filter | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | filter solution |
| Glacial acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP staining |
| Glucose meter | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | Serial number:COJJG8GW |
| Grinder | Shanghaijingxin Experimental Technology | Tissuelyser-24 | |
| Hematoxylin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D005 | TRAP staining |
| Insulin syringe | Shanghai Kantaray Medical Devices Co. | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | Intraperitoneal injection |
| L-(+) tartaric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP staining |
| Microscope | OLYMPUS | sz61 | Observation |
| Microtome | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | Section |
| Mini centrifuge | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | Centrifuge |
| Naphthol AS-BI phosphate | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP staining |
| Naringenin | Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd | 102764 | Solute |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | Embed samples |
| Pararosaniline base | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP staining |
| Pipettes | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | transferre Liquid |
| Plate reader | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 imaging reader | ELISA |
| Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | Neutral balsam | TRAP staining |
| saline (0.9 PS) | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | Solvent |
| Sodium acetate anhydrous | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP staining |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP staining |
| Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | Emulsifier |
| Zirconia beads | Shanghaijingxin Experimental Technology | 11079125z 454g | Grinding |
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