הכנת פתרון נרינגנין ליישום In Vivo
Summary
כאן, הפרוטוקול מציג את הכנת הפתרון naringenin עבור ניהול intraperitoneal in vivo. נרינגנין מומס במלואו בתערובת של דימתיל-סולפוקסיד, טווין 80 ותמלחות. ההשפעות האוסטאופורוטיות האנטי-סוכרתיות של נרינגנין הוערכו על ידי בדיקות גלוקוז בדם, צביעת חומצה פוספטאז עמידה בפני טרטרט ובדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזימים.
Abstract
הכנת תמיסה תרכובת (פיטוכימית) היא שלב מתעלם אך קריטי לפני יישומה במחקרים כגון בדיקת תרופות. ההסתגרות המלאה של התרכובת נחוצה לשימושה הבטוח ולתוצאותיה היציבות יחסית. כאן, פרוטוקול להכנת תמיסת נרינגנין וניהול תוך-צפקית שלה בתזונה עתירת שומן ומודל סוכרתי המושרה על ידי סטרפטוזוטוצין (STZ) מודגם כדוגמה. כמות קטנה של נרינגנין (3.52-6.69 מ”ג) שימשה לבדיקת המסיסות שלו בממסים, כולל אתנול, דימתיל-סולפוקסיד (DMSO) ו-DMSO בתוספת Tween 80 ששוחזר במי מלח פיזיולוגיים (PS), בהתאמה. סולוביזציה מלאה של התרכובת נקבעת על ידי התבוננות בצבע התמיסה, נוכחות של משקעים לאחר צנטריפוגה (2000 x g במשך 30 שניות), או מתן אפשרות לתמיסה לעמוד במשך שעתיים בטמפרטורת החדר (RT). לאחר קבלת תרכובת/תמיסה פיטוכימית יציבה, ניתן להכין את הריכוז/הכמות הסופיים של התרכובת הנדרשת למחקרי in vivo בתמיסת מלאי ממס בלבד (ללא PS), ולאחר מכן לדלל/לערבב עם PS לפי הצורך. ההשפעות האוסטיאופורוטיות האנטי-סוכרתיות של נרינגנין בעכברים (מתן תוך-צפק במינון 20 מ”ג/ק”ג b.w., 2 מ”ג/מ”ל) הוערכו על-ידי מדידת רמת הגלוקוז בדם, מסת העצם (מיקרו-CT) וקצב ספיגת העצם (מכתים TRAP ו-ELISA). חוקרים המחפשים תכשירים מפורטים לתמיסות אורגניות/פיטוכימיות יפיקו תועלת מטכניקה זו.
Introduction
עם מחקרים הולכים וגוברים הנוגעים לשימוש בתרכובות פיטוכימיות לבדיקת תרופות, כדאי לתת תשומת לב לגישות להכנת פתרונות פיטוכימיים להערכת ההשפעות האופטימליות שלהם. יש לקחת בחשבון היבטים רבים כגון מתודולוגיית הפירוק, המינון והריכוז בעת הכנת התרכובת1.
פירוק מבוסס ממס נמצא בשימוש נרחב להכנת תרכובת אורגנית1. הממסים הנפוצים כוללים מים, שמן, דימתיל סולפוקסיד (DMSO), מתנול, אתנול, חומצה פורמית, טווין, גליצרין וכו‘2. אף על פי שתרחיף עם חומרים לא פתורים מקובל כאשר התרכובת ניתנת על ידי gavage קיבה, מומס מומס לחלוטין הוא קריטי עבור מתן תוך ורידי. מאז תמיסת שמן, השעיה, ותחליב יכול לגרום תסחיפים נימיים, תמיסה מימית להכנת תרכובת מומלץ, במיוחד בעת מתן זריקות תוך ורידי, תוך שרירי, intraperitoneal3.
טווח המינון האפקטיבי משתנה בין תרכובות ואפילו בין מחלות שטופלו באותה תרכובת. קביעת המינון היעיל והבטוח והריכוז תלויים בספרות ובניסויים ראשוניים4. כאן, הכנת המתחם naringenin מודגם כדוגמה.
Naringenin (4,5,7-trihydroxy-flavanone), תרכובת פוליפנולית, נחקרה בטיפול במחלות עבור פעילויות hepatoprotective5, אנטי סוכרתי6, אנטי דלקתיות7, ונוגד חמצון8. עבור יישומי in vivo, מתן אוראלי של naringenin הוא נפוץ בשימוש. מחקרים קודמים דיווחו על הכנת תמיסת נרינגנין ב-0.5%-1% קרבוקסימתיל צלולוז, 0.5% מינון מתילצלולוז, 0.01% DMSO, ותמיסת מלח פיזיולוגית (PS) במינון 50-100 מ”ג/ק”ג, הניתנת על ידי גבאג’פומי 9,10,11,12. חוץ מזה, מחקרים אחרים דיווחו על נטילת תוסף נרינגנין עם צ’או ב-3% (wt/wt) לצריכה פומית במינון של 3.6 גרם/ק”ג/ד’13,14. מחקרים דיווחו גם על שימוש באתנול (0.5% v/v), PS ו-DMSO כדי להמיס נרינגנין להזרקה תוך-צפקית במינון 10-50 מ”ג/ק”ג15,16,17,18. במחקר על אפילפסיה של האונה הרקתית, עכברים קיבלו זריקה של נרינגנין שהושהתה ב-0.25% קרבוקסימתיל צלולוז מומס ב-PS19. אף על פי שמחקרים אלה מדווחים על שימוש בממסים שונים להכנת תמיסות נרינגנין, לא דווח על פרטים נוספים, כגון מצב המסה ותגובה של בעלי חיים.
פרוטוקול זה מציג הליך להכנת תמיסת נרינגנין ליישום in vivo באוסטאופורוזיס הנגרמת על ידי סוכרת. הכנת תמיסת ההזרקה כוללת הכנת ממסים ותרכובות, הערכת מינון, תהליך פירוק וסינון. המינון נקבע על סמך מחקרים ספרותיים וניסויים ראשוניים על ידי ניטור עכברים לאחר מתן זריקות מדי יום במשך 3 ימים ושינוי המינון בהתאם להתנהגויות העכברים. הריכוז הסופי שנבחר (20 מ”ג/ק”ג b.w.) ניתן תוך צפק 5 ימים בשבוע במשך 8 שבועות בתזונה עתירת שומן ועכברים סוכרתיים הנגרמים על ידי סטרפטוזוטוצין (STZ)20,21. ההשפעות של נרינגנין באוסטאופורוזיס סוכרתי הוערכו על ידי בדיקות גלוקוז בדם, מיקרו-CT, צביעת חומצה פוספטאז עמידה לטרטרט (TRAP) ובדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזים (ELISA).
באופן כללי, נצפה כי נרינגנין בטווח ריכוזים של 40-400 מ”ג/מ”ל לא התמוסס לחלוטין באתנול או ב-DMSO או ב-5% (אתנול או DMSO) בתוספת 95% PS (v/v). עם זאת, נרינגנין התמוסס לחלוטין בתערובת של 3.52% DMSO, 3.52% טווין 80 ו-92.96% PS. ההליך המפורט יסייע לחוקרים להכין את התרכובת כפתרון הזרקה ליישום in vivo .
Protocol
Representative Results
Discussion
הכנת הפתרון הפיטוכימי היא הבסיס ליישומו in vivo. בפרוטוקול זה, הכנת תמיסת נרינגנין הודגמה על ידי שימוש בממיסים שונים, כגון אתנול, DMSO, Tween 80 ו- 0.9% PS. הפתרון במצב מומס לחלוטין צריך להיות מנוטר עוד יותר על ידי מתן אפשרות להישאר בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות ממושכות, ולאחר מכן מסונן לפני השימוש <e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81973607 ו-81573992).
Materials
| 1.5 mL microtubes | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | Holding liquid |
| Automatic Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | Dehydrate samples |
| Blood glucose test strips | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
| Centrifuge | MIULAB | Minute centrifuge | Centrifugal solution |
| Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | Dehydration |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | Co-Solvent |
| ELISA assay kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c Mouse CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c |
|
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | Co-Solvent |
| Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | Decalcification |
| Filter | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | filter solution |
| Glacial acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP staining |
| Glucose meter | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | Serial number:COJJG8GW |
| Grinder | Shanghaijingxin Experimental Technology | Tissuelyser-24 | |
| Hematoxylin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D005 | TRAP staining |
| Insulin syringe | Shanghai Kantaray Medical Devices Co. | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | Intraperitoneal injection |
| L-(+) tartaric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP staining |
| Microscope | OLYMPUS | sz61 | Observation |
| Microtome | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | Section |
| Mini centrifuge | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | Centrifuge |
| Naphthol AS-BI phosphate | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP staining |
| Naringenin | Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd | 102764 | Solute |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | Embed samples |
| Pararosaniline base | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP staining |
| Pipettes | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | transferre Liquid |
| Plate reader | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 imaging reader | ELISA |
| Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | Neutral balsam | TRAP staining |
| saline (0.9 PS) | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | Solvent |
| Sodium acetate anhydrous | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP staining |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP staining |
| Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | Emulsifier |
| Zirconia beads | Shanghaijingxin Experimental Technology | 11079125z 454g | Grinding |
References
- Stoye, D. Solvents. Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry. , (2000).
- Bouchard, D., et al. Optimization of the solvent-based dissolution method to sample volatile organic compound vapors for compound-specific isotope analysis. Journal of Chromatography A. 1520, 23-34 (2017).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (5), 600-613 (2011).
- Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33 (3), 378-455 (2012).
- Hernández-Aquino, E., Muriel, P. Beneficial effects of naringenin in liver diseases: Molecular mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 24 (16), 1679-1707 (2018).
- Den Hartogh, D. J., Tsiani, E. Antidiabetic properties of naringenin: A citrus fruit polyphenol. Biomolecules. 9 (3), (2019).
- Tutunchi, H., Naeini, F., Ostadrahimi, A., Hosseinzadeh-Attar, M. J. Naringenin, a flavanone with antiviral and anti-inflammatory effects: A promising treatment strategy against COVID-19. Phytotherapy Research. 34 (12), 3137-3147 (2020).
- Zaidun, N. H., Thent, Z. C., Latiff, A. A. Combating oxidative stress disorders with citrus flavonoid: Naringenin. Life Sciences. 208, 111-122 (2018).
- Tsuhako, R., Yoshida, H., Sugita, C., Kurokawa, M. Naringenin suppresses neutrophil infiltration into adipose tissue in high-fat diet-induced obese mice. Journal of Natural Medicines. 74 (1), 229-237 (2020).
- Annadurai, T., et al. Antihyperglycemic and anti-oxidant effects of a flavanone, naringenin, in streptozotocin-nicotinamide-induced experimental diabetic rats. Journal of Physiology and Biochemistry. 68 (3), 307-318 (2012).
- Li, S., et al. Naringenin improves insulin sensitivity in gestational diabetes mellitus mice through AMPK. Nutrition & Diabetes. 9 (1), 28 (2019).
- Devan, S., Janardhanam, V. A. Effect of Naringenin on metabolic markers, lipid profile and expression of GFAP in C6 glioma cells implanted rat’s brain. Annals of Neurosciences. 18 (4), 151-155 (2011).
- Burke, A. C., et al. Naringenin enhances the regression of atherosclerosis induced by a chow diet in Ldlr-/- mice. Atherosclerosis. 286, 60-70 (2019).
- Assini, J. M., et al. Naringenin prevents obesity, hepatic steatosis, and glucose intolerance in male mice independent of fibroblast growth factor 21. Endocrinology. 156 (6), 2087-2102 (2015).
- Alifarsangi, A., Esmaeili-Mahani, S., Sheibani, V., Abbasnejad, M. The citrus flavanone naringenin prevents the development of morphine analgesic tolerance and conditioned place preference in male rats. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 47 (1), 43-51 (2020).
- Sirovina, D., Oršolić, N., Gregorović, G., Končić, M. Z. Naringenin ameliorates pathological changes in liver and kidney of diabetic mice: a preliminary study. Archives of Occupational Hygiene and Toxicology. 67 (1), 19-24 (2016).
- Nguyen-Ngo, C., Willcox, J. C., Lappas, M. Anti-diabetic, anti-inflammatory, and anti-oxidant effects of Naringenin in an In vitro human model and an in vivo murine model of gestational diabetes mellitus. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (19), 1900224 (2019).
- Ahmed, L. A., Obaid, A. A. Z., Zaki, H. F., Agha, A. M. Naringenin adds to the protective effect of L-arginine in monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats: favorable modulation of oxidative stress, inflammation and nitric oxide. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 62, 161-170 (2014).
- Park, J., et al. Naringenin ameliorates kainic acid-induced morphological alterations in the dentate gyrus in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Neuroreport. 27 (15), 1182-1189 (2016).
- Matsui, H., et al. Early-stage Type 2 diabetes mellitus impairs erectile function and neurite outgrowth from the major pelvic ganglion and downregulates the gene expression of neurotrophic factors. Urology. 99, 1-7 (2017).
- Sharma, G., Ashhar, M. U., Aeri, V., Katare, D. P. Development and characterization of late-stage diabetes mellitus and -associated vascular complications. Life Sciences. 216, 295-304 (2019).
- Rowe, R. C., Sheskey, P. J., Owen, S. C. . Handbook of Pharmaceutical Excipients. , (2003).
- Fallahi, F., Roghani, M., Moghadami, S. Citrus flavonoid naringenin improves aortic reactivity in streptozotocin-diabetic rats. Indian Journal of Pharmacology. 44 (3), 382-386 (2012).
- Liu, F., Yang, H., Zhou, W. Comparison of the characteristics of induced and spontaneous db/db mouse models of type 2 diabetes mellitus. Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica. 22 (6), 54-59 (2014).
- Liu, S., Dong, J., Bian, Q. A dual regulatory effect of naringenin on bone homeostasis in two diabetic mice models. Traditional Medicine and Modern Medicine. 03 (02), 101-108 (2020).
- Sun, C., Wu, Z., Wang, Z., Zhang, H. Effect of ethanol/water solvents on phenolic profiles and anti-oxidant properties of beijing propolis extracts. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015, 595393 (2015).
- Huaman-Castilla, N. L., et al. The impact of temperature and ethanol concentration on the global recovery of specific polyphenols in an integrated HPLE/RP process on carménère pomace extracts. Molecules. 24 (17), (2019).
- van Thriel, C. Toxicology of solvents (including alcohol). Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
- Linakis, J. G., Cunningham, C. L. Effects of concentration of ethanol injected intraperitoneally on taste aversion, body temperature, and activity. Psychopharmacology. 64 (1), 61-65 (1979).
- Magwaza, L. S., et al. Rapid methods for extracting and quantifying phenolic compounds in citrus rinds. Food Science & Nutrition. 4 (1), 4-10 (2016).
- Smith, E. R., Hadidian, Z., Mason, M. M. The single–and repeated–dose toxicity of dimethyl sulfoxide. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 96-109 (1967).
- Colucci, M., et al. New insights of dimethyl sulphoxide effects (DMSO) on experimental in vivo models of nociception and inflammation. Pharmacological Research. 57 (6), 419-425 (2008).
- Kawakami, K., Oda, N., Miyoshi, K., Funaki, T., Ida, Y. Solubilization behavior of a poorly soluble drug under combined use of surfactants and co-solvents. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (1-2), 7-14 (2006).
