Приготовление раствора нарингенина для применения in vivo
Summary
Здесь в протоколе представлен препарат раствора нарингенина для внутрибрюшинного введения in vivo . Нарингенин полностью растворен в смеси диметилсульфоксида, Tween 80 и физиологического раствора. Антидиабетические остеопоротические эффекты нарингенина оценивали с помощью тестирования глюкозы в крови, окрашивания тартраторезистентной кислотной фосфатазы и иммуноферментного анализа.
Abstract
Приготовление соединения (фитохимического) раствора является упущенным, но критическим этапом до его применения в таких исследованиях, как скрининг лекарств. Полная солюбилизация соединения необходима для его безопасного использования и относительно стабильных результатов. Здесь в качестве примера показан протокол приготовления раствора нарингенина и его внутрибрюшинного введения в диете с высоким содержанием жиров и диабетическая модель, индуцированная стрептозотоцином (СТЗ). Небольшое количество нарингенина (3,52-6,69 мг) использовалось для проверки его солюбилизации в растворителях, включая этанол, диметилсульфоксид (ДМСО) и ДМСО плюс Tween 80, восстановленный в физиологическом растворе (PS), соответственно. Полную солюбилизацию соединения определяют наблюдением за цветом раствора, наличием осадков после центрифугирования (2000 х г в течение 30 с) или разрешением раствору стоять в течение 2 ч при комнатной температуре (РТ). После получения стабильного соединения/фитохимического раствора конечную концентрацию/количество соединения, необходимое для исследований in vivo , можно приготовить в растворе только для растворителя (без PS), а затем разбавить/смешать с PS по желанию. Антидиабетические остеопоротические эффекты нарингенина у мышей (внутрибрюшинное введение при 20 мг/кг веса тела, 2 мг/мл) оценивали путем измерения уровня глюкозы в крови, костной массы (микро-КТ) и скорости резорбции кости (окрашивание TRAP и ИФА). Исследователи, ищущие подробные органические / фитохимические препараты растворов, выиграют от этого метода.
Introduction
В связи с расширением исследований, касающихся использования фитохимических соединений для скрининга лекарственных средств, следует обратить внимание на подходы к приготовлению фитохимических растворов для оценки их оптимального воздействия. Многие аспекты, такие как методология растворения, дозировка и концентрация, должны учитываться при приготовлении соединения1.
Растворение на основе растворителя широко используется для получения органических соединений1. Обычно используемые растворители включают воду, масло, диметилсульфоксид (DMSO), метанол, этанол, муравьиную кислоту, Tween, глицерин и т.д.2. Хотя суспензия с нерастворенными веществами приемлема, когда соединение вводится желудочным раствором, полностью растворенное растворенное вещество имеет решающее значение для внутривенного введения. Поскольку масляный раствор, суспензия и эмульсия могут вызывать капиллярные эмболии, предлагается водный раствор для приготовления соединения, особенно при введении внутривенных, внутримышечных и внутрибрюшинных инъекций3.
Эффективный диапазон доз варьируется между соединениями и даже между заболеваниями, обработанными одним и тем же соединением. Определение эффективной и безопасной дозы и концентрации зависит от литературы и предварительных экспериментов4. Здесь в качестве примера демонстрируется препарат соединения нарингенин.
Нарингенин (4,5,7-тригидрокси-флаванон), полифенольное соединение, был изучен при лечении заболевания по его гепатопротекторной5, антидиабетической6, противовоспалительной7 и антиоксидантной активности8. Для применения in vivo обычно используется пероральное введение нарингенина. В предыдущих исследованиях сообщалось о приготовлении раствора нарингенина в 0,5%-1% карбоксиметилцеллюлозы, 0,5% дозы метилцеллюлозы, 0,01% ДМСО и физиологического физиологического раствора (PS) в 50-100 мг/кг, вводимого пероральным приемом 9,10,11,12. Кроме того, в других исследованиях сообщалось о добавлении нарингенина чау в 3% (масс./мас.) для перорального приема в дозе 3,6 г/кг/сут13,14. Исследования также сообщали об использовании этанола (0,5% v/v), PS и DMSO для растворения нарингенина для внутрибрюшинной инъекции при 10-50 мг/кг 15,16,17,18. В исследовании эпилепсии височной доли мыши получали инъекцию нарингенина, суспендированного в 0,25% карбоксиметилцеллюлозы, растворенной в PS19. Хотя в этих исследованиях сообщается об использовании различных растворителей для приготовления растворов нарингенина, дальнейшие подробности, такие как статус растворения и реакция животных, не были сообщены.
Этот протокол вводит процедуру приготовления раствора нарингенина для применения in vivo при диабетическом остеопорозе. Приготовление раствора для инъекций включает приготовление растворителей и соединений, оценку дозировки, процесс растворения и фильтрацию. Дозировка была определена на основе литературных исследований и предварительных экспериментов путем мониторинга мышей после введения инъекций каждый день в течение 3 дней и изменения дозировки в соответствии с поведением мыши. Окончательную выбранную концентрацию (20 мг/кг веса тела) вводили внутрибрюшинно 5 дней в неделю в течение 8 недель в диете с высоким содержанием жиров и индуцированным стрептозотоцином (STZ)-индуцированными диабетическими мышами20,21. Эффекты нарингенина при диабетическом остеопорозе оценивались с помощью тестирования глюкозы в крови, микро-КТ, окрашивания тартраторезистентной кислотной фосфатазы (TRAP) и иммуноферментного анализа (ИФА).
В целом было отмечено, что нарингенин в диапазоне концентраций 40-400 мг/мл полностью не растворялся ни в этаноле, ни в ДМСО, ни в 5% (этанол или ДМСО) плюс 95% PS (v/v). Однако нарингенин полностью растворяют в смеси 3,52% ДМСО, 3,52% Tween 80 и 92,96% PS. Подробная процедура поможет исследователям приготовить соединение в виде инъекционного раствора для применения in vivo .
Protocol
Representative Results
Discussion
Приготовление фитохимического раствора является основой для его применения in vivo. В этом протоколе получение раствора нарингенина было продемонстрировано с использованием различных растворителей, таких как этанол, DMSO, Tween 80 и 0,9% PS. Раствор в полностью растворенном состоянии необх?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81973607 и 81573992).
Materials
| 1.5 mL microtubes | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | Holding liquid |
| Automatic Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | Dehydrate samples |
| Blood glucose test strips | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
| Centrifuge | MIULAB | Minute centrifuge | Centrifugal solution |
| Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | Dehydration |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | Co-Solvent |
| ELISA assay kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c Mouse CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c |
|
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | Co-Solvent |
| Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | Decalcification |
| Filter | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | filter solution |
| Glacial acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP staining |
| Glucose meter | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | Serial number:COJJG8GW |
| Grinder | Shanghaijingxin Experimental Technology | Tissuelyser-24 | |
| Hematoxylin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D005 | TRAP staining |
| Insulin syringe | Shanghai Kantaray Medical Devices Co. | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | Intraperitoneal injection |
| L-(+) tartaric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP staining |
| Microscope | OLYMPUS | sz61 | Observation |
| Microtome | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | Section |
| Mini centrifuge | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | Centrifuge |
| Naphthol AS-BI phosphate | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP staining |
| Naringenin | Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd | 102764 | Solute |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | Embed samples |
| Pararosaniline base | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP staining |
| Pipettes | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | transferre Liquid |
| Plate reader | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 imaging reader | ELISA |
| Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | Neutral balsam | TRAP staining |
| saline (0.9 PS) | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | Solvent |
| Sodium acetate anhydrous | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP staining |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP staining |
| Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | Emulsifier |
| Zirconia beads | Shanghaijingxin Experimental Technology | 11079125z 454g | Grinding |
References
- Stoye, D. Solvents. Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry. , (2000).
- Bouchard, D., et al. Optimization of the solvent-based dissolution method to sample volatile organic compound vapors for compound-specific isotope analysis. Journal of Chromatography A. 1520, 23-34 (2017).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (5), 600-613 (2011).
- Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33 (3), 378-455 (2012).
- Hernández-Aquino, E., Muriel, P. Beneficial effects of naringenin in liver diseases: Molecular mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 24 (16), 1679-1707 (2018).
- Den Hartogh, D. J., Tsiani, E. Antidiabetic properties of naringenin: A citrus fruit polyphenol. Biomolecules. 9 (3), (2019).
- Tutunchi, H., Naeini, F., Ostadrahimi, A., Hosseinzadeh-Attar, M. J. Naringenin, a flavanone with antiviral and anti-inflammatory effects: A promising treatment strategy against COVID-19. Phytotherapy Research. 34 (12), 3137-3147 (2020).
- Zaidun, N. H., Thent, Z. C., Latiff, A. A. Combating oxidative stress disorders with citrus flavonoid: Naringenin. Life Sciences. 208, 111-122 (2018).
- Tsuhako, R., Yoshida, H., Sugita, C., Kurokawa, M. Naringenin suppresses neutrophil infiltration into adipose tissue in high-fat diet-induced obese mice. Journal of Natural Medicines. 74 (1), 229-237 (2020).
- Annadurai, T., et al. Antihyperglycemic and anti-oxidant effects of a flavanone, naringenin, in streptozotocin-nicotinamide-induced experimental diabetic rats. Journal of Physiology and Biochemistry. 68 (3), 307-318 (2012).
- Li, S., et al. Naringenin improves insulin sensitivity in gestational diabetes mellitus mice through AMPK. Nutrition & Diabetes. 9 (1), 28 (2019).
- Devan, S., Janardhanam, V. A. Effect of Naringenin on metabolic markers, lipid profile and expression of GFAP in C6 glioma cells implanted rat’s brain. Annals of Neurosciences. 18 (4), 151-155 (2011).
- Burke, A. C., et al. Naringenin enhances the regression of atherosclerosis induced by a chow diet in Ldlr-/- mice. Atherosclerosis. 286, 60-70 (2019).
- Assini, J. M., et al. Naringenin prevents obesity, hepatic steatosis, and glucose intolerance in male mice independent of fibroblast growth factor 21. Endocrinology. 156 (6), 2087-2102 (2015).
- Alifarsangi, A., Esmaeili-Mahani, S., Sheibani, V., Abbasnejad, M. The citrus flavanone naringenin prevents the development of morphine analgesic tolerance and conditioned place preference in male rats. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 47 (1), 43-51 (2020).
- Sirovina, D., Oršolić, N., Gregorović, G., Končić, M. Z. Naringenin ameliorates pathological changes in liver and kidney of diabetic mice: a preliminary study. Archives of Occupational Hygiene and Toxicology. 67 (1), 19-24 (2016).
- Nguyen-Ngo, C., Willcox, J. C., Lappas, M. Anti-diabetic, anti-inflammatory, and anti-oxidant effects of Naringenin in an In vitro human model and an in vivo murine model of gestational diabetes mellitus. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (19), 1900224 (2019).
- Ahmed, L. A., Obaid, A. A. Z., Zaki, H. F., Agha, A. M. Naringenin adds to the protective effect of L-arginine in monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats: favorable modulation of oxidative stress, inflammation and nitric oxide. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 62, 161-170 (2014).
- Park, J., et al. Naringenin ameliorates kainic acid-induced morphological alterations in the dentate gyrus in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Neuroreport. 27 (15), 1182-1189 (2016).
- Matsui, H., et al. Early-stage Type 2 diabetes mellitus impairs erectile function and neurite outgrowth from the major pelvic ganglion and downregulates the gene expression of neurotrophic factors. Urology. 99, 1-7 (2017).
- Sharma, G., Ashhar, M. U., Aeri, V., Katare, D. P. Development and characterization of late-stage diabetes mellitus and -associated vascular complications. Life Sciences. 216, 295-304 (2019).
- Rowe, R. C., Sheskey, P. J., Owen, S. C. . Handbook of Pharmaceutical Excipients. , (2003).
- Fallahi, F., Roghani, M., Moghadami, S. Citrus flavonoid naringenin improves aortic reactivity in streptozotocin-diabetic rats. Indian Journal of Pharmacology. 44 (3), 382-386 (2012).
- Liu, F., Yang, H., Zhou, W. Comparison of the characteristics of induced and spontaneous db/db mouse models of type 2 diabetes mellitus. Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica. 22 (6), 54-59 (2014).
- Liu, S., Dong, J., Bian, Q. A dual regulatory effect of naringenin on bone homeostasis in two diabetic mice models. Traditional Medicine and Modern Medicine. 03 (02), 101-108 (2020).
- Sun, C., Wu, Z., Wang, Z., Zhang, H. Effect of ethanol/water solvents on phenolic profiles and anti-oxidant properties of beijing propolis extracts. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015, 595393 (2015).
- Huaman-Castilla, N. L., et al. The impact of temperature and ethanol concentration on the global recovery of specific polyphenols in an integrated HPLE/RP process on carménère pomace extracts. Molecules. 24 (17), (2019).
- van Thriel, C. Toxicology of solvents (including alcohol). Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
- Linakis, J. G., Cunningham, C. L. Effects of concentration of ethanol injected intraperitoneally on taste aversion, body temperature, and activity. Psychopharmacology. 64 (1), 61-65 (1979).
- Magwaza, L. S., et al. Rapid methods for extracting and quantifying phenolic compounds in citrus rinds. Food Science & Nutrition. 4 (1), 4-10 (2016).
- Smith, E. R., Hadidian, Z., Mason, M. M. The single–and repeated–dose toxicity of dimethyl sulfoxide. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 96-109 (1967).
- Colucci, M., et al. New insights of dimethyl sulphoxide effects (DMSO) on experimental in vivo models of nociception and inflammation. Pharmacological Research. 57 (6), 419-425 (2008).
- Kawakami, K., Oda, N., Miyoshi, K., Funaki, T., Ida, Y. Solubilization behavior of a poorly soluble drug under combined use of surfactants and co-solvents. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (1-2), 7-14 (2006).
