En metode til udvinding af cofaktor F420 fra rene kulturer blev optimeret til flydende kromatografisk adskillelse og analyse af F420 halelængde i ren kultur og miljøprøver.
Cofaktoren F420 spiller en central rolle som hydridbærer i den primære og sekundære metabolisme hos mange bakterielle og arkæiske taxa. Cofaktoren er bedst kendt for sin rolle i methanogenese, hvor det letter termodynamisk vanskelige reaktioner. Da polyglutamat halen varierer i længde mellem forskellige organismer, kan længdeprofilanalyser være et kraftfuldt værktøj til at skelne og karakterisere forskellige grupper og veje i forskellige levesteder. Her beskriver protokollen udvindingen og optimeringen af cofaktor F420-påvisning ved at anvende fastfaseudvinding kombineret med højtydende flydende kromatografianalyse uafhængigt af kulturelle eller molekylære biologiske tilgange. Metoden blev anvendt til at få yderligere oplysninger om cofaktor F420’s udtryk fra mikrobielle samfund i jord, anaerobe slam og rene kulturer og blev evalueret ved spiking eksperimenter. Dermed lykkedes det undersøgelsen at generere forskellige F420 halelængdeprofiler for hydrogenotrofisk og acetoclastic methanogener i kontrollerede methanogenic rene kulturer samt fra miljøprøver som anaerobe rådnetankslam og jord.
F420 er en udbredt, men ofte forsømt cofaktor, der fungerer som en obligatorisk to-elektronhydridbærer i primære og sekundære metaboliske processer i både Archaea og Bacteria1,2. F420 er en 5-deazaflavin og strukturelt ligner flavins, hvorved dens kemiske og biologiske egenskaber er mere sammenlignelige med nad + eller NADP +. På grund af substitution af kvælstof med kulstof ved position 5 i isoalloxazinringen er det et stærkt reduktant, hvilket udviser et lavt standard redox-potentiale på -340 mV1,3. F420 består af en 5-deazaflavin ring og en 2-fosfo-L-laktat linker (F420-0). En oligoglutamat hale, der indeholder n+1 glutamatmonomerer, kan fastgøres til molekylet (F420-n+1)4.
I lang tid har cofaktoren F420 udelukkende været forbundet med Archaea og Actinobacteria. Dette er stort set blevet væltet. Nylige analyser viste, at F420 er fordelt på forskellige anerobe og aerobe organismer i phyla Proteobacteria, Chloroflexi, og potentielt Firmicutes beboer et utal af levesteder som jord, søer, og den menneskelige tarm1,5. I 2019 viste Braga et al.6, at proteobacterium Paraburkholderia rhizoxinica producerer et unikt F420-derivat, der indeholder en 3-fosphoglycerate i stedet for en 2-fosfolactathale, som kan være udbredt i forskellige levesteder. Inden for domænet Archaea, F420 er blevet fundet i flere slægter, herunder methanogenic7, methanotrofisk8,9, og sulfat-reducerende ordrer10, og formodes at være produceret i Thaumarchaeota11. F420 er bedst kendt som et essentielt redox coenzym i hydrogenotrofisk og methylotrofisk methanogenese. Den reducerede form af F420 (F420H2) fungerer som elektrondonor til reduktion af methylentetrahydromethanopterin (methylen-H4MPT, Mer) og methenyl-H4MPT12,13. Det kan også bruges som en elektronbærer i H2-uafhængige elektrontransportveje af methanogener, der indeholder cytochromes12,14. Desuden har den oxiderede form af F420 en karakteristisk blågrøn fluorescens ved excitation ved 420 nm, hvilket letter påvisning af methanogener mikroskopisk (figur 1). På grund af det lave redoxpotentiale letter F420 (i) den udefrakommende reduktion af et bredt spektrum af ellers genstridige eller giftige organiske forbindelser, ii) syntese af tetracyklin- og lincosamid antibiotika eller phytotoktoksin i streptomycetes (phylum Actinobacteria) og (iii) resistens over for oxidativ eller nitrosativ stress eller andre ugunstige tilstande i mycobacteria (phylum Actinobacteria)1,5,15 16,17,18,19,20,21,22. Derfor er F420-afhængige oxidoreductaser lovende biokatalysatorer til industrielle og farmaceutiske formål samt til biorensning af forurenede miljøer1,23. På trods af disse nylige resultater er de nøjagtige roller for cofaktoren F420 stadig marginalt kendt i Actinobacteria eller anden bakteriel phyla.
Der er mindst tre veje til F420 biosyntese2,6,24. I begyndelsen er biosyntesevejen opdelt i en 5-deazaflavin biosyntese og en 2-fosfolactat metabolismegren. Den reaktive del af F420-molekylet syntetiseres via FO-synthase ved hjælp af substraterne tyrosin og 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinedion. Resultatet er riboflavin niveau chromophore FO. Inden for den aktuelt accepterede laktatmetabolismegren fosforyleres L-laktat til 2-fosfo-L-laktat af en L-laktatkinase (CofB); 2-fosfo-L-laktat, igen, er guanyleret til L-lactyl-2-diphospho-5′-guanosin ved 2-fosfo-L-laktat guanylyltransferase (CofC). I næste trin er L-lactyl-2-diphospho-5′-guanosin forbundet med FO ved en 2-fosfo-L-laktatoverførselase (CofD) til F420-02. Endelig enzymet F420-0:ɣ-glutamyl ligase (CofE) ligates glutamat monomers til F420-0, danner den endelige cofaktor6 i varierende antal23,25. Forskellige organismer viser forskellige mønstre i antallet af tilknyttede glutamatrester, med kortere haler fundet for methanogener end i mycobacteria2,25,26. Generelt viser methanogener halelængder fra to til tre, med op til fem i acetoclastic methanogen, Methanosarcina sp., mens halelængder fundet i Mycobacterium sp. varierede fra fem til syv glutamatrester2,25,26,27. De seneste resultater viste imidlertid, at F420 med lang kæde binder sig til F420-afhængige oxidoreductaser med en højere affinitet end kortkædet F420; Desuden øger bundne langkædede F420 substrataffiniteten, men reducerer omsætningen af de respektive enzymer23.
Påvisning af cofaktor F420 er ofte baseret på dens fluorescens. Derved blev dens oligo glutamat derivater adskilt ved hjælp af omvendt fase (RP)-HPLC27,28. For nylig brugte Ney et al. tetrabutylammoniumhydroxid som et ionparringsreagens til den negativt ladede glutamathale for at forbedre adskillelsen på RP-HLPC med succes5. Her præsenterer vi en metode til fremstilling af prøver, efterfølgende lysis, udvinding, rensning, adskillelse og kvantificering af cofaktor F420 ikke kun fra rene kulturer, men også fra forskellige miljøprøver (dvs. jord og rådnende slam).
Til evaluering af cofaktor F420 fra methanogenic rene kulturer kan der udføres en mikroskopisk evaluering for at visualisere væksten og aktiviteten (fluorescensmikroskopi) af de involverede mikroorganismer (figur 1). For prøver, der stammer fra naturlige miljøer, er brugen af mikroskopi til at detektere eller kvantificere F420 begrænset på grund af interferens med andre fluorescerende mikroorganismer, organiske og uorganiske partikler. I denne forbindelse kan ekst…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker taknemmeligt prof. Colin Jackson for støtten med renset cofaktor F420. Denne forskning blev støttet af Tyrols videnskabsfond (TWF) og Universität Innsbruck (Publikationsfonds). Vi anerkender i høj grad støtten fra GPS, HK, SB, GG og HB.
Autoclave | |||
Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector | Shimadzu | HPLC system | |
Centrifuge and rotor for 50 mL “Falcon” tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes | |||
HPLC Column: Gemini NX C18, 5 μm, 150 x 3 mm | Phenomenex | HPLC column | |
PTFE filter (pore size 0.22 µm) to remove particulate matter prior HPLC analysis | |||
Resin for SPE: Strata-X-AW 33 μm as weak anion mixed-mode polymeric sorbent | Phenomenex | weak anion mixed-mode polymeric sorbent | |
Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes | SPE equipment | ||
Vortex mixer |