הפקת קופקטור F420 לניתוח אורך זנב פוליגלוטאמט מתרבויות טהורות מתנוגניות ודגימות סביבתיות
Summary
שיטה להפקת קופקטור F420 מתרבויות טהורות הייתה מותאמת להפרדה וניתוח כרומטוגרפי נוזלי של אורך הזנב F420 בתרבות טהורה ודגימות סביבתיות.
Abstract
ה- F420 של קופקטור ממלא תפקיד מרכזי כנשא הידריד בחילוף החומרים העיקרי והמשני של מסה חיידקית וארכאלית רבים. קופקטור ידוע בעיקר בשל תפקידו במתנוגנזה, שם הוא מקל על תגובות קשות תרמודינמית. כמו הזנב polyglutamate משתנה באורך בין אורגניזמים שונים, ניתוחי פרופיל אורך עשוי להיות כלי רב עוצמה להבחנה ואפיון קבוצות שונות מסלולים בבתי גידול שונים. כאן, הפרוטוקול מתאר את החילוץ והאופטימיזציה של זיהוי F420 קופקטור על ידי החלת מיצוי שלב מוצק בשילוב עם ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים ללא תלות בגישות ביולוגיות תרבותיות או מולקולריות. השיטה יושמה כדי לקבל מידע נוסף על הביטוי של קופקטור F420 מקהילות מיקרוביות בקרקעות, בוצה אנאירובית, ותרבויות טהורות, והוערכה על ידי ניסויים spiking. ובכך, המחקר הצליח לייצר פרופילים שונים באורך הזנב F420 עבור מתנוגנים מימנוטרופיים ואצטוקלסטיים בתרבויות טהורות מתנוגניות מבוקרות, כמו גם מדגימות סביבתיות כגון בוצה מעכל אנאירובי ואדמה.
Introduction
F420 הוא קופקטור נפוץ אך מוזנח לעתים קרובות, המתפקד כנשא הידריד דו-אלקטרוני מחייב בתהליכים מטבוליים ראשוניים ומשניים של ארכיאה וחיידק1,2. F420 הוא 5-דיזפלבין ודומה מבחינה מבנית flavins, לפי תכונותיו הכימיות והביולוגיות דומים יותר עם אלה של NAD + או NADP +. בשל החלפת חנקן עם פחמן במיקום 5 של טבעת isoalloxazine, הוא רדויטנט חזק, ובכך מציג פוטנציאל redox סטנדרטי נמוך של -340 mV1,3. F420 כולל טבעת 5-דיזפלבין ומקשר 2-phospho-L-לקטט (F420-0). זנב אוליגלוטאמט המכיל n+1 מונומרים גלוטמט יכול להיות מחובר למולקולה (F420-n +1)4.
במשך זמן רב, F420 קופקטור היה קשור אך ורק עם ארכאיה ו Actinobacteria. זה התהפך ברובו. ניתוחים אחרונים גילו כי F420 מופץ בין אורגניזמים אנאירוביים ואירוביים מגוונים של פילה פרוטאובקטריה, כלורופלקסי, וייתכן ש- Firmicutes המאכלסים מספר עצום של בתי גידול כמו קרקעות, אגמים, והמעיים האנושיים1,5. בשנת 2019, בראגה ואח’6, הראו כי פרוטאובקטריום Paraburkholderia rhizoxinica מייצר נגזרת F420 ייחודית, המכילה 3-פוספוגליצרט במקום זנב 2-פוספט, אשר עשוי להיות נפוץ בבתי גידול שונים. בתוך התחום Archaea, F420 נמצא במספר שושלות, כולל methanogenic7, מתאנוטרופיק8,9, והזמנות להפחתת גופרית10, והוא אמור להיות מיוצר Thaumarchaeota11. F420 ידוע בעיקר בשם קואנזים אדום חיוני במתנוגנזה מינוטרופית ומתילוטרופית. הצורה המופחתת של F420 (F420H2) מתפקדת כתורמת אלקטרונים להפחתת מתילנטרהידרומתנופטרין (מתילן-H4MPT, מר) ומתניל-H4MPT12,13. זה יכול לשמש גם כנשא אלקטרונים במסלולי הובלת אלקטרונים עצמאיים H2 של מתנוגנים המכילים ציטוכרום12,14. יתר על כן, הצורה החמצונית של F420 יש פלואורסצנטיות כחולה-ירוקה אופיינית עם עירור ב 420 ננומטר, אשר מאפשר זיהוי של מתנוגנים מיקרוסקופיים (איור 1). בשל פוטנציאל redox הנמוך שלה, F420 מאפשר (i) הפחתה אקסוגנית של ספקטרום רחב של תרכובות אורגניות סרבנות או רעילות אחרת, (ii) סינתזה של טטרציקלין ואנטיביוטיקה לינקוסמיד או פיטוטוקסינים בסטרפטומיאצטים (פילום אקטינובקטריה), ו -(iii) עמידות ללחץ חמצוני או ניטרוסטיבי או תנאים שליליים אחרים במיקובקטריה (פילום אקטינובקטריה)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. כתוצאה מכך, חמצון תלוי F420 הם biocatalysts מבטיחים למטרות תעשייתיות ותרופות, כמו גם עבור תיווך ביולוגי של סביבות מזוהמות1,23. למרות הממצאים האחרונים, התפקידים המדויקים של F420 קופקטור עדיין ידועים בשוליים Actinobacteria או פילה חיידקי אחר.
ישנם לפחות שלושה מסלולים לביוסינתזה F4202,6,24. בהתחלה, מסלול הביוסינתזה מחולק לביוסינתזה של 5-דיזפלבין וענף חילוף חומרים של 2-פוספולקטאט. החלק הריאקטיבי של מולקולת F420 מסונתז באמצעות FO-סינתאז באמצעות טירוזין המצע ו 5-אמינו-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinedione. התוצאה היא רמת הריבופלבין כרומופור FO. בתוך ענף חילוף החומרים לקטט המקובל כיום, L-לקטט הוא זרחן 2-phospho-L-לקטט על ידי קינאז L-לקטט (CofB); 2-פוספו-L-לקטט, בתורו, הוא guanylated ל L-לקטיל-2-דיפוספו-5′-גואנוסין על ידי 2-פוספו-L-לקטט guanylyltransferase (CofC). בשלב הבא, L-לקטיל-2-דיפוספו-5′-גואנוסין מקושר ל- FO על ידי טרנספראז 2-phospho-L-לקטט (CofD) ליצירת F420-02. לבסוף, האנזים F420-0:ɣ-גלוטמיל ליגאז (CofE) ליגאטות גלוטמט מונומרים ל- F420-0, ויוצר את קופקטור הסופי6 במספרים משתנים23,25. אורגניזמים שונים מראים דפוסים שונים במספר שאריות גלוטמט מחוברות, עם זנבות קצרים יותר שנמצאו עבור מתנוגנים מאשר mycobacteria2,25,26. בדרך כלל, מתנוגנים מראים אורך זנב משניים עד שלושה, עם עד חמישה מתנוגן אצטוקלסטי, מתנוזרצ’ינה sp., בעוד אורכי הזנב שנמצאו Mycobacterium sp. נע בין חמישה לשבע שאריות גלוטמט2,25,26,27. עם זאת, הממצאים האחרונים הראו כי F420 ארוך שרשרת נקשר חמצון תלוי F420 עם זיקה גבוהה יותר מאשר F420 קצר שרשרת; יתר על כן, F420 קשור שרשרת ארוכה מגביר את הזיקה מצע אבל מקטין את שיעור המחזור של אנזימים בהתאמה23.
זיהוי של קופקטור F420 מבוסס לעתים קרובות על הפלואורסצנטיות שלו. ובכך, נגזרי הגלוטמט אוליגו שלה הופרדו באמצעות שלב הפוך (RP)-HPLC27,28. לאחרונה, Ney ואח ‘ השתמש tetrabutylammonium הידרוקסיד כמו ריאגנט זיווג יונים עבור זנב גלוטמט טעון שלילי כדי לשפר את ההפרדה על RP-HLPC בהצלחה5. כאן, אנו מציגים שיטה להכנת דגימות, תמוגה לאחר מכן, מיצוי, טיהור, הפרדה וכימות של קופקטור F420 לא רק מתרבויות טהורות אלא גם מדגימות סביבתיות שונות (כלומר, קרקעות בוצה מעכל).
Protocol
Representative Results
Discussion
להערכת קופקטור F420 מתרביות טהורות מתנוגניות, ניתן לבצע הערכה מיקרוסקופית כדי לדמיין את הצמיחה והפעילות (מיקרוסקופיה פלואורסצנטית) של המיקרואורגניזמים המעורבים (איור 1). עבור דגימות הנובעות מסביבות טבעיות, השימוש במיקרוסקופיה כדי לזהות או לכמת F420 מוגבל עקב הפרע…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים להכרת תודה לפרופ’ קולין ג’קסון על התמיכה ב-F420 המטוהר. מחקר זה נתמך על ידי קרן המדע טירולי (TWF) ואוניברסיטת Innsbruck (Publikationsfonds). אנו מכירים מאוד בתמיכתם של GPS, HK, SB, GG ו- HB.
Materials
| Autoclave | |||
| Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector | Shimadzu | HPLC system | |
| Centrifuge and rotor for 50 mL “Falcon” tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes | |||
| HPLC Column: Gemini NX C18, 5 μm, 150 x 3 mm | Phenomenex | HPLC column | |
| PTFE filter (pore size 0.22 µm) to remove particulate matter prior HPLC analysis | |||
| Resin for SPE: Strata-X-AW 33 μm as weak anion mixed-mode polymeric sorbent | Phenomenex | weak anion mixed-mode polymeric sorbent | |
| Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes | SPE equipment | ||
| Vortex mixer |
References
- Greening, C., et al. Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).
- Bashiri, G., et al. A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes. Nature Communications. 10 (1), 451 (2019).
- Grinter, R., Greening, C. Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea. FEMS Microbiology Reviews. , (2021).
- Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium. 생화학. 17 (22), 4583-4593 (1978).
- Ney, B., et al. The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria. The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).
- Braga, D., et al. Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420. ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).
- Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments. Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).
- Michaelis, W., et al. Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane. Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).
- Knittel, K., Lösekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps. Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).
- Lin, X. -. L., White, R. H. Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria. Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).
- Spang, A., et al. The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations. Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).
- Mand, T. D., Metcalf, W. W. Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).
- Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis. Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).
- Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri. mBio. 9 (4), (2018).
- Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea. FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).
- Purwantini, E., Daniels, L. Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis. Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).
- McCormick, J. R. D., Morton, G. O. Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species. Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).
- Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -. S. T., Yurek, D. A. Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis. The Journal of Antibiotics. 42 (3), 472-474 (1989).
- Bown, L., Altowairish, M. S., Fyans, J. K., Bignell, D. R. D. Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase. Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).
- Gurumurthy, M., et al. A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents. Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).
- Greening, C., et al. Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism. Frontiers in Microbiology. 8, 1000 (2017).
- Mathew, S., Trajkovic, M., Kumar, H., Nguyen, Q. -. T., Fraaije, M. W. Enantio- and regioselective ene-reductions using F420H2-dependent enzymes. Chemical Communications. 54 (79), 11208-11211 (2018).
- Ney, B., et al. Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases. Frontiers in Microbiology. 8, 1902 (2017).
- Grinter, R., et al. Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria. mSystems. 5 (3), (2020).
- Peck, M. W. Changes in concentrations of coenzyme F420 analogs during batch growth of Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei. Applied and Environmental Microbiology. 55 (4), (1989).
- Gorris, L. G., vander Drift, C. Cofactor contents of methanogenic bacteria reviewed. BioFactors. 4 (3-4), 139-145 (1994).
- Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species. Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).
- Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain). Microbial Ecology. 61, (2011).
- Wagner, A. O., et al. Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155 (2019).
- Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila. Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).
- Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments. Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).
- Wagner, A. O., et al. Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants. Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).
- Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis. PloS one. 5 (12), 15803 (2010).
