शुद्ध संस्कृतियों से cofactor F420 के निष्कर्षण के लिए एक विधि तरल क्रोमैटोग्राफिक अलगाव और शुद्ध संस्कृति और पर्यावरण यी नमूनों में F420 पूंछ लंबाई के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया गया था।
Cofactor F420 कई जीवाणु और archaeal taxa के प्राथमिक और माध्यमिक चयापचय में एक हाइड्राइड वाहक के रूप में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है। कोफ़ैक्टर को मेथेनोजेनेसिस में अपनी भूमिका के लिए जाना जाता है, जहां यह थर्मोडायनामिक रूप से कठिन प्रतिक्रियाओं की सुविधा प्रदान करता है। चूंकि पॉलीग्लूटामेट पूंछ विभिन्न जीवों के बीच लंबाई में भिन्न होती है, लंबाई प्रोफ़ाइल विश्लेषण विभिन्न आवासों में विभिन्न समूहों और मार्गों को अलग करने और विशेषता के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है। यहां, प्रोटोकॉल सांस्कृतिक या आणविक जैविक दृष्टिकोणों से स्वतंत्र उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी विश्लेषण के साथ संयुक्त ठोस-चरण निष्कर्षण को लागू करके कोफ़ैक्टर F420 का पता लगाने के निष्कर्षण और अनुकूलन का वर्णन करता है। इस विधि को मिट्टी, अवायवीय कीचड़ और शुद्ध संस्कृतियों में माइक्रोबियल समुदायों से कोफ़ैक्टर F420 की अभिव्यक्ति पर अतिरिक्त जानकारी प्राप्त करने के लिए लागू किया गया था और स्पाइकिंग प्रयोगों द्वारा मूल्यांकन किया गया था। इस प्रकार, अध्ययन नियंत्रित मेथेनोजेनिक शुद्ध संस्कृतियों में हाइड्रोजनोट्रोफिक और एसिटोक्लास्टिक मेथेनोजेन के साथ-साथ एनारोबिक डाइजेस्टर कीचड़ और मिट्टी जैसे पर्यावरणीय नमूनों से हाइड्रोजनोट्रोफिक और एसिटोक्लास्टिक मेथेनोजेन के लिए विभिन्न एफ 420 पूंछ-लंबाई प्रोफाइल उत्पन्न करने में सफल रहा।
F420 एक व्यापक लेकिन अक्सर उपेक्षित cofactor है, जो Archaea और Bacteria1,2 दोनों की प्राथमिक और माध्यमिक चयापचय प्रक्रियाओं में एक बाध्य दो-इलेक्ट्रॉन हाइड्राइड वाहक के रूप में कार्य करता है। F420 एक 5-deazaflavin है और संरचनात्मक रूप से flavins के समान है, जिससे इसके रासायनिक और जैविक गुण NAD + या NADP + के उन लोगों के साथ अधिक तुलनीय हैं। isoalloxazine अंगूठी की स्थिति 5 पर कार्बन के साथ नाइट्रोजन के प्रतिस्थापन के कारण, यह एक मजबूत रिडक्टेंट है, इस प्रकार -340 mV1,3 की कम मानक रेडॉक्स क्षमता का प्रदर्शन करता है। F420 में एक 5-deazaflavin अंगूठी और एक 2-फॉस्फो-एल-लैक्टेट लिंकर (F420-0) शामिल है। एन + 1 ग्लूटामेट मोनोमर्स युक्त एक ओलिगोग्लूटामेट पूंछ को अणु (F420-n + 1)4 से जोड़ा जा सकता है।
एक लंबे समय के लिए, cofactor F420 पूरी तरह से Archaea और Actinobacteria के साथ जुड़ा हुआ है। इसे काफी हद तक पलट दिया गया है। हाल के विश्लेषणों से पता चला है कि F420 को फाइला प्रोटिओबैक्टीरिया, क्लोरोफ्लेक्सी के विविध अवायवीय और एरोबिक जीवों के बीच वितरित किया जाता है, और संभावित रूप से फर्मिक्यूट्स मिट्टी, झीलों और मानव आंत 1,5 जैसे असंख्य आवासों में रहते हैं। 2019 में, Braga et al.6, से पता चला है कि proteobacterium Paraburkholderia rhizoxinica एक अद्वितीय F420 व्युत्पन्न का उत्पादन करता है, जिसमें 2-फॉस्फोलेक्टेट पूंछ के बजाय 3-फॉस्फोग्लिसरेट होता है, जो विभिन्न आवासों में व्यापक हो सकता है। डोमेन Archaea के भीतर, F420 कई वंशों में पाया गया है, जिसमें मेथेनोजेनिक 7, मेथानोट्रोफिक 8, 9, और सल्फेट-कम करने वाले ऑर्डर 10 शामिल हैं, और इसे थाउमरचायोटा 11 में उत्पादित किया जाना चाहिए। F420 को हाइड्रोजनोट्रॉफिक और मेथिलोट्रोफिक मेथेनोजेनेसिस में एक आवश्यक रेडॉक्स कोएंजाइम के रूप में जाना जाता है। F420 (F420H2) का कम रूप मेथिलीनटेट्राहाइड्रोमेथेनोप्टेरिन (मेथिलीन-H4MPT, Mer) और मेथेनिल-H4MPT12,13 की कमी के लिए एक इलेक्ट्रॉन दाता के रूप में कार्य करता है। इसका उपयोग साइटोक्रोम 12,14 युक्त मेथेनोजेन के एच 2-स्वतंत्र इलेक्ट्रॉन परिवहन मार्गों में एक इलेक्ट्रॉन वाहक के रूप में भी किया जा सकता है। इसके अलावा, F420 के ऑक्सीकरण रूप में 420 एनएम पर उत्तेजना पर एक विशेषता नीले-हरे रंग की प्रतिदीप्ति होती है, जो माइक्रोस्कोपिक रूप से मेथेनोजेन का पता लगाने की सुविधा प्रदान करती है (चित्रा 1)। इसकी कम रेडॉक्स क्षमता के कारण, F420 सुविधा प्रदान करता है (i) अन्यथा अड़ियल या विषाक्त कार्बनिक यौगिकों के एक व्यापक स्पेक्ट्रम की बहिर्जात कमी, (ii) टेट्रासाइक्लिन और लिनकोसामाइड एंटीबायोटिक दवाओं या स्ट्रेप्टोमाइसेट्स (फाइलम एक्टिनोबैक्टीरिया) में फाइटोटॉक्सिन का संश्लेषण, और (iii) ऑक्सीडेटिव या नाइट्रोसेटिव तनाव या माइकोबैक्टीरिया में अन्य प्रतिकूल स्थितियों के लिए प्रतिरोध (फाइलम एक्टिनोबैक्टीरिया)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. नतीजतन, F420-निर्भर oxidoreductases औद्योगिक और दवा उद्देश्यों के साथ-साथ दूषित वातावरण के बायोरेमेडिएशन के लिए बायोकैटालिस्ट का वादा कर रहे हैं1,23। इन हाल के निष्कर्षों के बावजूद, cofactor F420 की सटीक भूमिकाअभी भी एक्टिनोबैक्टीरिया या अन्य जीवाणु फाइला में मामूली रूप से ज्ञात है।
F420 जैवसंश्लेषण 2,6,24 के लिए कम से कम तीन रास्ते हैं। शुरुआत में, जैवसंश्लेषण मार्ग को 5-deazaflavin जैवसंश्लेषण और 2-फॉस्फोलेक्टेट चयापचय शाखा में विभाजित किया जाता है। F420 अणु के प्रतिक्रियाशील भाग को FO-synthase के माध्यम से संश्लेषित किया जाता है, जो सब्सट्रेट्स टायरोसिन और 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinedione का उपयोग करता है। परिणाम राइबोफ्लेविन स्तर क्रोमोफोर एफओ है। वर्तमान में स्वीकृत लैक्टेट चयापचय शाखा के भीतर, एल-लैक्टेट को एल-लैक्टेट किनेज (कोएफबी) द्वारा 2-फॉस्फो-फॉस्फो-एल-लैक्टेट के लिए फॉस्फोराइलेटेड किया जाता है; 2-फॉस्फो-एल-लैक्टेट, बदले में, 2-फॉस्फो-एल-लैक्टेट गुआनिलट्रांसफरेज़ (सीओएफसी) द्वारा एल-लैक्टिल-2-डिफॉस्फो-5′-गुआनोसिन के लिए गुआनिलेटेड है। अगले चरण में, L-lactyl-2-diphospho-5′-guanosine को FO से 2-फॉस्फो-L-lactate transferase (CofD) द्वारा F420-02 बनाने के लिए जोड़ा गया है। अंत में, एंजाइम F420-0: π-glutamyl ligase (CofE) ग्लूटामेट मोनोमर्स को F420-0 पर लिगेट करता है, जो अलग-अलग संख्याओं में अंतिम cofactor6 बनाता है23,25। विभिन्न जीव संलग्न ग्लूटामेट अवशेषों की संख्या में अलग-अलग पैटर्न दिखाते हैं, जिसमें माइकोबैक्टीरिया 2,25,26 की तुलना में मेथेनोजेन के लिए छोटी पूंछ पाई जाती है। आम तौर पर, मेथेनोजेन दो से तीन तक पूंछ की लंबाई दिखाते हैं, जिसमें एसिटोक्लास्टिक मेथेनोजेन, मेथानोसारसिना एसपी में पांच तक होते हैं, जबकि माइकोबैक्टीरियम एसपी में पाई जाने वाली पूंछ की लंबाई पांच से सात ग्लूटामेट अवशेष2,25,26,27 तक होती है। हालांकि, हाल के निष्कर्षों से पता चला है कि लंबी श्रृंखला F420 शॉर्ट-चेन F420 की तुलना में उच्च आत्मीयता के साथ F420-निर्भर ऑक्सीडोरेडक्टेस को बांधती है; इसके अलावा, बाध्य लंबी श्रृंखला F420 सब्सट्रेट आत्मीयता बढ़ जाती है लेकिन संबंधित एंजाइमों की टर्नओवर दर कम हो जाती है23.
Cofactor F420 का पता लगाना अक्सर इसकी प्रतिदीप्ति पर आधारित होता है। इस प्रकार, इसके ओलिगो ग्लूटामेट डेरिवेट्स को उलट-चरण (आरपी) -एचपीएलसी 27,28 का उपयोग करके अलग किया गया था। हाल ही में, नेय एट अल ने आरपी-एचएलपीसी पर अलगाव को बढ़ाने के लिए नकारात्मक रूप से चार्ज ग्लूटामेट पूंछ के लिए आयन-युग्मन अभिकर्मक के रूप में टेट्राब्यूटिलामोनियम हाइड्रॉक्साइड का उपयोग सफलतापूर्वक किया। यहां, हम नमूनों की तैयारी के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं, बाद में लाइसिस, निष्कर्षण, शुद्धिकरण, अलगाव, और कोफ़ैक्टर F420 का परिमाणीकरण न केवल शुद्ध संस्कृतियों से बल्कि विभिन्न पर्यावरणीय नमूनों (यानी, मिट्टी और डाइजेस्टर कीचड़) से भी।
मेथेनोजेनिक शुद्ध संस्कृतियों से कोफ़ैक्टर F420 के मूल्यांकन के लिए, शामिल सूक्ष्मजीवों के विकास और गतिविधि (प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी) की कल्पना करने के लिए एक सूक्ष्म मूल्यांकन किया जा सकता है (<st…
The authors have nothing to disclose.
हम कृतज्ञतापूर्वक शुद्ध cofactor F420 के साथ समर्थन के लिए प्रोफेसर कॉलिन जैक्सन को धन्यवाद देते हैं। इस शोध को Tyrolean Science Fund (TWF) और Universität Innsbruck (Publikationsfonds) द्वारा समर्थित किया गया था। हम जीपीएस, एचके, एसबी, जीजी और एचबी के समर्थन को बहुत स्वीकार करते हैं।
Autoclave | |||
Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector | Shimadzu | HPLC system | |
Centrifuge and rotor for 50 mL “Falcon” tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes | |||
HPLC Column: Gemini NX C18, 5 μm, 150 x 3 mm | Phenomenex | HPLC column | |
PTFE filter (pore size 0.22 µm) to remove particulate matter prior HPLC analysis | |||
Resin for SPE: Strata-X-AW 33 μm as weak anion mixed-mode polymeric sorbent | Phenomenex | weak anion mixed-mode polymeric sorbent | |
Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes | SPE equipment | ||
Vortex mixer |